《Cell Reports Methods》：ON-Time enables rapid microbiome sequencing and analysis for precision medicine
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常规用于精准医疗的微生物组测序受限于较长周转时间、复杂流程和高成本。研究人员旨在解决这些局限，开发简化且快速的湿实验流程，并结合点选式数据分析，以实现快速、准确、经济高效的微生物组分析。临床中重症监护病房(ICU)的微生物组指导疗法需要快速分析患者微生物组以指
常规用于精准医疗的微生物组测序受限于较长周转时间、复杂流程和高成本。研究人员旨在解决这些局限，开发简化且快速的湿实验流程，并结合点选式数据分析，以实现快速、准确、经济高效的微生物组分析。临床中重症监护病房(ICU)的微生物组指导疗法需要快速分析患者微生物组以指导紧急治疗决策；常规微生物组测序与分析存在长周转时间、方法学复杂和高成本等障碍。研究人员提出一种名为ON-Time的方法，可对单个患者粪便样本进行快速（样本到结果小于5小时）且准确的宏基因组测序与分类学分析。ON-Time采用简化快速湿实验流程与点选式数据分析。其准确性与精密度通过既定模拟微生物群落，以及与ICU患者样本常规鸟枪法宏基因组学的头对头比较进行验证。关键局限包括抗菌药耐药性(AMR)和毒力因子等功能基因的非确定性识别。综上，ON-Time提供了一种快速、准确、经济高效的单个患者样本分析方法，可获取具临床可操作性的微生物组特征以指导个性化治疗。
研究背景方面，人与动物研究已表明肠道微生物组的病理性改变会促进多种急性疾病的发病并导致不良结局，微生物组修饰疗法正进入临床试验与真实世界应用。然而，在ICU等急性医疗场景中，常规微生物组分析方法——包括16S rRNA扩增子测序和短读长鸟枪法宏基因组学——存在周转时间长、流程复杂、成本高、难以按需分析单例样本等问题，无法满足时效性强临床决策需求。因此，研究人员开展本研究以开发并验证一种称为ON-Time的快速、低成本、用户友好的个体患者微生物组分析方法，用于ICU患者粪便（直肠拭子）样本的临床可行分析。
主要关键技术方法方面，研究人员使用来自卡尔加里Foothills医学中心内科、外科、神经科和创伤ICU患者直肠拭子样本，以及健康志愿者样本；采用Qiagen DNeasy PowerSoil Kit进行DNA分离，Oxford Nanopore Technologies(ONT) Rapid Barcoding Kit 24 V14进行快速文库制备，ONT MinION Mk1B配合Flongle流动池进行长读长实时测序，Epi2Me中Kraken2进行分类学注释，并用ZymoBIOMICS D6300与D6331标准微生物群落验证；同时与Illumina NovaSeq 6000短读长鸟枪法宏基因组学头对头比较；功能组学通过Epi2Me内置Abricate结合ResFinder与VFDB分析抗菌药耐药性(AMR)及毒力基因。
研究结果如下。ON-Time快速微生物组分析表征ICU个体危重患者粪便微生物组：研究人员从直肠拭子出发优化DNA分离、文库制备、测序与生物信息学流程，证实湿实验约1.75小时、测序稳定指标在3小时内获得，总样本到结果约4.8小时，并配套点选式网络应用输出临床可操作风险判断。多界分类学验证与ON-Time优化使用标准化微生物群落：通过ZymoBIOMICS群落重复实验，证明细菌与真菌分类学准确度与精密度良好，群落间差异显著，物种水平聚类稳定，真菌Candida albicans观察/理论比接近100%。ON-Time快速微生物组分析与常规鸟枪法宏基因组学比较评估：在34例样本头对头比较中，β多样性无显著差异，科与种水平分类组成高度一致，Enterobacteriaceae相对丰度在健康者与ICU患者间区分能力相当，最优势菌科一致率88.2%，Enterobacteriaceae为最优势时一致率100%。ON-Time用于AMR与毒力决定因子功能基因组学分析：研究人员在20小时实时分析中可于3小时内检出独特AMR与毒力基因，但新基因与拷贝数持续累积、无平台期，因此3小时乃至20小时流程都不足以快速全面报告功能基因。
讨论部分总结：研究人员指出ON-Time弥补了常规方法在急性医疗中的关键缺陷，可在5小时内提供等价生态与分类学数据，且适合单样本按需、低基础设施与无生信背景使用者。其可识别ICU中具可治疗微生物组靶标的患者，从而推动精准微生物组修饰干预与更高效的临床试验入组。该平台还可拓展至骨髓移植、肿瘤、感染病等场景及其他体部样本，但低生物量样本需宿主DNA去除与流程优化。局限包括功能基因组学覆盖不足、直肠拭子高微生物量前提、阈值需按人群细化、稀有分类群需进一步验证，前瞻性随机对照试验（如NCT07463339）将检验其临床影响。
研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员描述并验证了一种称为ON-Time的的患者粪便样本快速微生物组分析方法。数据显示ON-Time可在小于4.8小时内从ICU患者粪便（直肠拭子）样本产生准确且精密的微生物组数据。ON-Time结果通过模拟群落及与常规短读长鸟枪法宏基因组学头对头比较得到验证。与常规微生物组测序方法（16S rRNA基因扩增子测序与鸟枪法宏基因组学）相比，ON-Time具有按需单样本经济高效、流程简化（更少更简单的湿实验步骤与点选式生物信息学）和最低基础设施需求（笔记本连接MinION Mk1B设备）的优势。综上，ON-Time提供了一种快速、准确且经济高效的方法来分析了单个患者肠道微生物组，以识别用于靶向（个性化）治疗的可操作微生物组数据。
