《Aquaculture Reports》：Spatiotemporal regulation of apolipoproteins LcApoa1 and LcApoa4 in lipid transport and anti-inflammatory response of
Larimichthys crocea fed fishmeal-free diets
编辑推荐：
全球鱼粉短缺使得植物源蛋白在水产饲料中的应用成为必要，但其抗营养因子常损害肉食性鱼类（如大黄鱼 *Larimichthys crocea*）的营养利用。本研究探讨了无鱼粉饲料投喂下大黄鱼饲料效率（feed efficiency，FE）差异的分子机制。研究人员选
全球鱼粉短缺使得植物源蛋白在水产饲料中的应用成为必要，但其抗营养因子常损害肉食性鱼类（如大黄鱼 *Larimichthys crocea*）的营养利用。本研究探讨了无鱼粉饲料投喂下大黄鱼饲料效率（feed efficiency，FE）差异的分子机制。研究人员选取饲料摄入量相当但饲料效率差异显著（高效组 vs. 低效组）的个体，采用数据非依赖采集质谱（data-independent acquisition mass spectrometry, DIA-MS）对前肠和后肠组织进行比较蛋白质组学分析。研究人员在前肠和后肠分别鉴定出210和200个差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）。功能富集分析揭示了明显的区域特化：前肠DEPs主要参与急性炎症反应和类固醇激素生物合成，而后肠DEPs富集于氨基酸和碳水化合物代谢通路。值得注意的是，研究人员观察到载脂蛋白的时空调控现象：LcApoa1在肝脏和前肠中上调表达，而LcApoa4在肝脏和后肠中升高。生物信息学表征表明，*Lcapoa1*（768 bp，255 aa）和*Lcapoa4*（765 bp，254 aa）各含一个载脂蛋白结构域。体外实验表明，重组LcApoa1（1.5 mg/mL）和LcApoa4（1.0 mg/mL）通过上调抗炎介质（TGF-β、IL-10）和下调促炎介质（TNF-α、IL-1β、IL-6）显著缓解β-伴大豆球蛋白诱导的大黄鱼肠道细胞（LYCI）炎症。综上所述，研究结果表明，协调的、区域特异性的载脂蛋白激活促进了无鱼粉饲料投喂下大黄鱼的脂质高效吸收和炎症控制。这些发现为培育高效品系和优化水产养殖中植物蛋白饲料配方提供了有前景的分子靶点。
论文解读：大黄鱼无鱼粉饲料适应中载脂蛋白LcApoa1与LcApoa4的时空调控机制
一、 研究背景与科学问题
饲料成本约占水产养殖生产成本的60%。鱼粉（fishmeal，FM）凭借其均衡的氨基酸组成、n-3长链多不饱和脂肪酸及未知生长因子而备受推崇，但资源日益稀缺且价格持续攀升。豆粕（soybean meal，SBM）是主要的鱼粉替代蛋白源，但其含有的蛋白酶抑制剂、植酸、凝集素和β-伴大豆球蛋白等抗营养因子，会诱发肉食性鱼类肠炎和肝脏损伤，损害营养利用效率。在大黄鱼（*Larimichthys crocea*）中，豆粕诱导的肠炎以肠绒毛萎缩、黏膜通透性增加及促炎细胞因子（IL-1β、TNF-α）上调为特征。然而，即使在相同养殖条件下，个体间的病理反应和饲料转化率（feed conversion ratio，FCR）仍存在显著差异。前期研究表明，饲喂植物蛋白饲料时，FCR较高的个体表现出更严重的肠道炎症和脂质吸收障碍，且伴随肠道黏膜结构和脂质转运相关酶活性的差异。大黄鱼作为中国年消耗鱼粉超过20万吨的肉食性海洋鱼类，在无鱼粉饲料投喂下表现出显著的个体间FCR变异。因此，解析高效利用植物蛋白饲料品系的分子基础，对降低鱼粉依赖和生产成本具有重要经济意义。
β-伴大豆球蛋白是豆粕来源的主要抗营养因子，通过激活TLR4/NF-κB信号通路促进过量促炎细胞因子分泌并破坏肠道屏障功能，是大黄鱼肠道炎症的关键诱导因子。在其他鱼类中，载脂蛋白已被证明具有拮抗此类效应的功能：例如，大口黑鲈（*Micropterus salmoides*）的Apoa1通过结合脂多糖（LPS）抑制NF-κB活化；部分硬骨鱼类的Apoa4同源物也参与免疫调控。然而，Apoa1和Apoa4是否在大黄鱼中发挥类似的保护作用尚不清楚。
脂质代谢和肠道免疫稳态是肉食性鱼类适应植物蛋白日粮的核心决定因素。载脂蛋白（apolipoprotein，Apo）是脂蛋白颗粒的结构支架，在脂质转运和免疫调节中发挥不可或缺的作用。ApoA-I和ApoA-II占高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）蛋白质量的60%以上。肝脏来源的ApoB100构成低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和极低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）的结构核心，而肠道ApoB48对乳糜微粒（chylomicron，CM）组装至关重要。ApoE分布于VLDL和HDL中，对脂蛋白受体识别和脂质转运至关重要。在水生动物中，载脂蛋白参与日粮脂质适应：斑马鱼（*Danio rerio*）高脂饮食下Apoa1表达上调，促进逆向胆固醇转运（reverse cholesterol transport，RCT）并减少肝脏脂质积累；大西洋鲑（*Salmo salar*）的Apoa4主要在肠道表达并对植物甾醇暴露产生响应，提示其具有缓解植物基日粮诱导的甾醇失衡的作用。然而，关于肉食性海洋鱼类载脂蛋白的组织特异性调控研究仍然有限。
研究人员前期的肝脏蛋白质组学分析发现，在高效利用无鱼粉日粮的大黄鱼个体中，脂质代谢和免疫相关通路——包括α-2-HS-糖蛋白（Ahsg）、ApoA1和ApoA4——显著上调，提示这些蛋白参与脂质转运和炎症控制。肠道和肝脏构成脂质代谢中协调的"肠-肝轴"：肠道是日粮脂质吸收的主要场所，肝脏则负责脂质的再酯化和再分配。然而，前期工作仅聚焦于肝脏调控，肠道载脂蛋白的调控——尤其是其在前肠与后肠的节段特异性表达和功能——尚待探索。
二、 研究方法概述
本研究基于浙江永兴水产种业有限公司提供的18月龄大黄鱼，经7天驯化后进行为期28天的养殖试验，从159尾保留双侧标签且生长呈阳性的个体中，依据饲料效率（FE = 增重/摄食量）筛选出摄食量无显著差异（p > 0.05）的高FE组（H组，3尾）和低FE组（L组，3尾）个体。采集前肠和后肠组织进行蛋白质组学分析。实验设计分为四组：H_QC（高FE前肠）vs. L_QC（低FE前肠）和H_HC（高FE后肠）vs. L_HC（低FE后肠）。主要技术方法包括：（1）采用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）结合DIA-NN数据库搜索进行蛋白质组学鉴定与定量，以p < 0.05且|log?FC| ≥ 0.585为阈值筛选差异表达蛋白（DEPs）；（2）运用GO功能富集和KEGG通路富集分析解析DEPs的生物学功能；（3）利用ExPASy、SignalP 6.0、NetPhos 3.1、ProtScale、SMART、Swiss-Model及MEGA 12.0等生物信息学工具对LcApoa1和LcApoa4进行理化性质、信号肽、磷酸化位点、保守结构域、三级结构及系统发育分析；（4）采用RT-qPCR检测健康大黄鱼12个组织中的基因表达谱；（5）通过大肠杆菌原核表达系统制备重组蛋白r-LcApoa1和r-LcApoa4，经Ni-IDA亲和层析纯化；（6）利用大黄鱼肠道（LYCI）细胞系建立β-伴大豆球蛋白诱导的肠炎模型，通过CCK-8法检测细胞活力，RT-qPCR检测炎性细胞因子mRNA表达水平。
三、 主要研究结果
（一）饲料效率表型特征
前期研究已报道详细的统计结果。高FE组与低FE组的摄食量无显著差异（p > 0.05），但高FE组的饲料转化率（FCR）显著低于低FE组（p < 0.01）。初始体重与FCR无相关性（r = -0.02，p = 0.816），表明初始规格不是饲料效率的决定因素。
（二）蛋白质鉴定与数据质量评估
DIA-MS在前肠中共鉴定到9533个蛋白质，其中9289个为两组共有；后肠中鉴定到9089个蛋白质，其中8790个为共有。主成分分析（PCA）显示，前肠和后肠中高、低FE组均呈现清晰分离，PC1和PC2在前肠中共解释49.11%的总方差，在后肠中解释45.11%的总方差，表明组内重复性好且存在与饲料效率相关的蛋白质组学特征。
（三）差异表达蛋白鉴定
以|log?FC| ≥ 0.585且p < 0.05为阈值，前肠共鉴定到210个DEPs（65个上调、145个下调），后肠共鉴定到200个DEPs（81个上调、119个下调）。高FE组前肠中Apoa1、Apoa4、Apob100、Il6和Tipel1上调，而Itgam和C9下调；后肠中Apoa4、Apob100和Ambp升高，而C1ql4、Shpk和Pp2aa下调。层级聚类分析证实两个肠段的高、低FE组均形成显著分离的表达簇。
（四）GO与KEGG通路富集分析
GO富集分析显示，前肠DEPs主要富集于急性炎症反应、缺氧诱导凋亡的负调控及未折叠蛋白反应等生物学过程；细胞组分方面涉及溶酶体、过氧化物酶体和内质网伴侣复合体；分子功能方面涉及蛋白激酶活性、蛋白折叠伴侣结合和糖基转移酶活性。后肠DEPs富集于氨基酸代谢过程、刷状缘膜组织和L-氨基酸转运；细胞组分包括刷状缘和细胞外囊泡；分子功能强调氧化还原酶、跨膜转运体和裂解酶活性。
KEGG通路富集进一步揭示了营养代谢和免疫调控的差异。前肠DEPs显著富集于类固醇激素生物合成、脂肪消化与吸收，以及与聚糖降解、视黄醇代谢、鞘脂代谢和NF-κB信号相关的通路。相比之下，后肠DEPs主要富集于氨基酸代谢通路（色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸、苯丙氨酸代谢），以及维生素消化与吸收、胆固醇代谢、细胞色素P450相关药物代谢和肾素-血管紧张素系统。
（五）LcApoa1和LcApoa4的结构与系统发育分析
*Lcapoa1*转录本（768 bp）编码255个氨基酸（28.8 kDa）的蛋白质，含14个氨基酸的信号肽和一个载脂蛋白结构域，预测有28个磷酸化位点（16个Thr、8个Ser、4个Tyr）。*Lcapoa4*（765 bp）编码254个氨基酸（28.6 kDa）的蛋白质，含15个氨基酸的信号肽和一个载脂蛋白结构域，预测有23个磷酸化位点（9个Thr、12个Ser、2个Tyr）。两种蛋白质均呈现载脂蛋白家族典型的α-螺旋结构。多序列比对显示，LcApoa1与其他硬骨鱼类的序列一致性为21.35%–98.82%，与棘头梅童鱼（*Collichthys lucidus*）和黄姑鱼（*Nibea albiflora*）亲缘关系最近；LcApoa4的序列一致性为14.32%–97.64%，同样与上述两种鱼类聚类。系统发育分析进一步证实，LcApoa1和LcApoa4分别与*C. lucidus*形成高支持率（bootstrap = 99%）的姐妹支，且与哺乳动物同源物明显分离。
（六）组织表达谱分析
RT-qPCR分析证实，*Lcapoa1*主要在肝脏中表达，而*Lcapoa4*主要在肠道中表达。
（七）重组蛋白的原核表达与纯化
利用大肠杆菌（*E. coli*）BL21(DE3)原核表达系统成功表达了pET-28a空载体及LcApoa1-His和LcApoa4-His融合蛋白。经Ni-IDA亲和层析纯化后，His标签的r-LcApoa1和r-LcApoa4在SDS-PAGE上迁移至约30 kDa，与预测分子量一致。
（八）重组蛋白的抗炎效应
在LYCI细胞中，1.5 mg/mL β-伴大豆球蛋白暴露显著降低了细胞活力。补充重组蛋白以剂量依赖方式缓解了这一效应：r-LcApoa1在1.0 mg/mL时使细胞活力恢复至NC水平，2.5 mg/mL以内维持活力但无进一步改善；r-LcApoa4在≥1.0 mg/mL时显著改善活力，高剂量出现平台效应。细胞因子表达分析表明，1.0 mg/mL r-LcApoa1显著降低IL-1β表达，1.5 mg/mL进一步降低IL-6和TNF-α水平，同时IL-10和TGF-β在1.5 mg/mL时显著上调。r-LcApoa4在1.0 mg/mL时显著下调IL-1β、IL-6和TNF-α并增强IL-10，而TGF-β仅在1.5 mg/mL时显著升高。综合确定r-LcApoa1的最佳浓度为1.5 mg/mL，r-LcApoa4为1.0 mg/mL。
四、 讨论与结论
本研究在前期肝脏蛋白质组学分析的基础上，揭示了大黄鱼在无鱼粉饲料投喂下前肠和后肠的节段特异性响应。高饲料效率个体在肝-前肠-后肠轴上表现出脂质代谢通路的协调激活，包括脂肪消化、胆固醇代谢和类固醇生物合成。载脂蛋白呈现明显的空间表达模式：LcApoa1主要在肝脏和前肠上调，支持初级脂质吸收；LcApoa4在肝脏和后肠富集，提示其参与胆固醇再分配；Apob100在所有组织中一致升高，可能介导系统性脂质动员。
高效的脂质利用是饲料效率改善的核心驱动力。鱼类可消化高达80%的日粮脂质，远高于蛋白质（64%）和碳水化合物（58%）的利用率，因此脂质高效利用可为体蛋白沉积节省蛋白质。ApoA1作为RCT的主要效应分子，通过ABCA1介导外周组织游离胆固醇外流，激活卵磷脂-胆固醇酰基转移酶（lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT）酯化HDL中的游离胆固醇，并经SR-BI将胆固醇酯转运至肝脏进行胆汁排泄。此外，ApoA1可通过结合LPS抑制NF-κB信号，减少促炎细胞因子释放并维持内皮完整性。ApoA4主要由肠上皮细胞在脂肪吸收期间合成，掺入富含甘油三酯的CM后分泌至肠淋巴，随后再分布至HDL或以无脂质形式循环。ApoA4同样促进HDL成熟、利于RCT并具有强抗炎效应。在无鱼粉日粮通常胆固醇含量低但植物甾醇丰富的情况下，Apoa1/Apoa4-HDL回收和Apob100-VLDL再分泌循环可防止植物甾醇积累，同时维持胆固醇供应。前肠中UDP-葡萄糖醛酸转移酶的上调进一步支持植物甾醇的消除。
缓解肠道抗营养应激是高FE组的另一优势。豆科抗营养因子激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）和急性炎症。前肠DEPs在这些通路中的富集表明前肠黏膜是主要靶点，而后肠通过AMPK信号维持能量平衡。Apoa1和Apoa4是充分证实的抗炎载脂蛋白：Apoa1-HDL可降低炎症内皮上VCAM-1和ICAM-1的表达，通过ABCA1激活Jak2/Stat3信号，并将TLR4从脂筏中移除，从而减弱NF-κB介导的细胞因子释放。Apoa4过表达可增强抗氧化防御（SOD、GSH-Px）并减少脂质过氧化（MDA），其敲除会加剧组织损伤和细胞因子释放。体外实验证实r-LcApoa1（1.5 mg/mL）和r-LcApoa4（1.0 mg/mL）显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α，同时升高IL-10和TGF-β，确认了它们直接的抗炎作用。
综合以上发现，本研究提出以下机制模型：在低鱼粉日粮条件下，脂质和植物甾醇首先以含Apoa4的CM形式从肠道输出，随后被富含Apoa1/Apoa4的HDL回收并返回肝脏，多余的植物甾醇在肝脏中被重新包装成含Apob100的VLDL并转运回肠道排泄。这一"肠-肝循环"与Apoa1/Apoa4介导的抗炎信号和UPR激活共同作用，维持脂质稳态并最大限度减少肠道炎症，最终支持高FE个体获得优良的饲料效率。研究结论为：载脂蛋白LcApoa1和LcApoa4在大黄鱼前肠和后肠中呈现区域特异性上调表达，通过促进脂质吸收和抑制肠道炎症，协同提高无鱼粉饲料下的饲料效率。这些发现为培育适应无鱼粉日粮的高效大黄鱼品系以及优化水产养殖中植物蛋白饲料配方提供了潜在的分子靶点和理论依据。
