《Genes》：Deep Learning-Guided Identification and In Vivo Validation of Compact Cis-Regulatory Elements for the Zebrafish Habenula
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背景/目标：对斑马鱼缰核的精准遗传操作仍受限于缺乏紧凑、序列明确的顺式调控元件（CREs）。为此，研究人员整合了发育表达图谱分析、长序列深度学习预测和体内报告基因检测，以鉴定驱动缰核表达的紧凑调控序列。方法：利用一株缰核报告基因表达富集的转基因斑马鱼品系，研究
背景/目标：对斑马鱼缰核的精准遗传操作仍受限于缺乏紧凑、序列明确的顺式调控元件（CREs）。为此，研究人员整合了发育表达图谱分析、长序列深度学习预测和体内报告基因检测，以鉴定驱动缰核表达的紧凑调控序列。方法：利用一株缰核报告基因表达富集的转基因斑马鱼品系，研究人员从幼虫脑中分离GFP阳性细胞并通过微阵列分析其转录组。在该数据集中富集的一部分候选基因通过两个发育阶段的整胚原位杂交进行了验证。该分析鉴定出具有高度可重复缰核表达的基因，从而选择gng8和ano2位点进行后续CRE特征研究。研究人员开发了ZEN-former（Zebrafish EN-former），一种基于Enformer的序列-功能模型，利用成年小鼠大脑的神经元亚类染色质可及性谱进行训练。结果：该模型在留出基因组区域中表现出预测信号与实验测量信号之间的强相关性。为优先筛选调控候选序列，研究人员将ZEN-former预测与可用的斑马鱼ATAC-seq数据、RepeatMasker注释和基因模型整合，在每个基因位点鉴定出两个约600 bp的区间。这些选定的区间被合并生成gng8和ano2位点约1.2 kb的报告基因构建体，并通过Tol2转座子介导的转基因实验在斑马鱼中评估。在瞬时注射的幼虫中，两种构建体均成功驱动缰核区域的报告基因表达。此外，所得稳定转基因品系表现出高度特异且可重复的缰核表达。定量共聚焦分析显示，gng8和ano2来源品系的平均缰核标记完整度分别为84.5%和96.2%。结论：综合这些发现提供了一种概念验证，即从哺乳动物染色质可及性数据集中学习到的序列特征可有效指导斑马鱼中跨物种功能调控元件的优先级排序。本研究生成的紧凑调控构建体和稳定转基因品系为研究缰核环路提供了稳健的遗传工具。
缰核是脊椎动物背侧间脑中高度保守的成对核团，参与焦虑相关行为、奖赏评估、学习和适应性行为等过程，并在情绪和厌恶处理的神经调控中发挥重要作用。哺乳动物缰核可分为内侧和外侧亚区，单细胞转录组分析进一步揭示了其显著的细胞和分子异质性，但建立这些细胞类型特异性身份和空间表达模式的顺式调控机制仍不清楚。斑马鱼因体积小、繁殖率高、易于遗传操作，且其背侧和腹侧缰核分别与哺乳动物内侧和外侧缰核具有同源关系，成为研究缰核发育和功能的理想模型。然而，现有的缰核遗传工具多依赖约200 kb的BAC转基因，虽能再现复杂表达模式，但难以鉴定具体负责细胞类型特异性活性的序列，且载体庞大限制了使用。因此，需要紧凑且序列明确的顺式调控元件（CREs）来提供更灵活的遗传工具，并直接研究缰核表达的顺式调控逻辑。该研究发表于《Genes》。
研究人员建立了一条将发育表达作图、深度学习调控谱预测和体内报告基因验证相结合的工作流程。主要关键方法包括：利用etx/ubtor/minar1增强子捕获转基因品系，通过荧光激活细胞分选（FACS）分离缰核富集的GFP阳性细胞并进行微阵列表达谱分析；在3和8 dpf两个发育阶段进行整胚原位杂交验证候选基因；基于Enformer架构构建ZEN-former序列-功能模型，并使用成年小鼠全脑约230万个细胞核、275个神经元亚类的snATAC-seq数据训练；整合ZEN-former预测、斑马鱼ATAC-seq数据、RepeatMasker注释和基因模型筛选候选CRE；采用Tol2转座子介导的转基因实验结合共聚焦定量评估体内活性。
3.1 缰核相关基因的原位验证
研究人员利用已有的增强子捕获系，在8 dpf获得缰核区域富集的转基因报告表达，通过FACS分离GFP阳性细胞，并以非荧光细胞为对照，同时纳入不在缰核表达的lhx5:Kaede和S313/nr0b1×GFP细胞作为神经元参照群体。微阵列数据经排序后，结合Allen小鼠脑图谱信息筛选出20个候选基因。整胚原位杂交显示，其中12个基因在3 dpf缰核区域高度富集表达：gng8、ano2、nwd2和gabbr1a呈双侧强表达；gnb4存在左右不对称；gpr139和prkcq局限于外侧缰核区域；pou4f1、trpm3、cacng5和kcnh5在缰核及更广神经区域表达；neurod1作为参照在缰核和多个脑区表达。8 dpf时这12个基因的缰核表达仍可检测到。基于特异性和可重复性，研究人员选择gng8和ano2位点进行后续CRE鉴定。
3.2 ZEN-former的开发与验证
由于原位杂交只能确定基因表达的空间模式，无法解析具体顺式调控序列，研究人员构建了序列-功能模型ZEN-former。该模型以196,608 bp的DNA序列为输入，输出275个成年小鼠脑细胞亚类在128 bp窗口中的染色质可及性调控谱。在训练中采用反向互补和随机位置偏移等序列增广策略，并使用多任务联合损失优化。在模型训练时留出的基因组区域上，ZEN-former对各细胞亚类预测信号与实验信号之间的Pearson相关系数平均为0.8667，中位数为0.8766，表明其能够学习可泛化的序列特征并再现细胞类型特异的调控谱。
3.3 在gng8和ano2位点鉴定候选CRE
研究人员将ZEN-former应用于斑马鱼gng8和ano2位点周围的基因组区域，并整合了斑马鱼ATAC-seq数据、RepeatMasker重复序列注释和基因模型。筛选标准包括：类归一化预测在缰核相关亚类中呈现明显富集峰；预测峰至少与一个独立斑马鱼ATAC-seq峰存在位置对应；剔除重复序列含量较高的区间。在gng8位点，研究人员选择了两个约600 bp的区间，其中一个位于gng8内含子内；在ano2位点，尽管该区域跨度超过110 kb、含近30个外显子且重复元件较多，仍鉴定出两个内含子候选区间。各位点的两个区间合并为一个约1.2 kb候选构建，用于后续体内评估。
3.4 候选CRE的体内评估
将gng8和ano2来源的候选序列克隆至含超核心启动子（SCP）和Gal4FF的Tol2增强子载体中，与UAS-PM-EGFP报告质粒及Tol2转座酶mRNA共注射入一细胞期斑马鱼胚胎。在F0幼虫中，gng8构建的29个EGFP阳性个体中有16个（55.2%）显示缰核报告基因表达，其中4个主要为缰核限制性表达；ano2构建的42个EGFP阳性个体中有17个（40.5%）显示缰核表达，其中3个主要为缰核限制性表达。将阳性F0养至成体并外交后，两种构建均获得种系传递的稳定F1转基因系。F1中gng8来源品系的42个EGFP阳性幼虫全部显示缰核限制性表达，ano2来源品系的24个EGFP阳性幼虫全部显示缰核特异且均匀的表达。定量共聚焦分析显示，gng8系和ano2系的平均缰核标记完整度分别为84.5±6.2%和96.2±1.8%，证明这两个稳定品系能够广泛覆盖缰核区域。
讨论部分指出，传统CRE发现策略通常依赖启动子邻近性、跨物种序列保守性或染色质可及性，但各自存在局限：启动子邻近搜索可能遗漏远端增强子，保守性分析可能忽略初级序列保守性弱的功能增强子，染色质可及性本身不能证明自主增强子活性或报告基因环境中的细胞类型特异性。gng8位点体现了在一个已有BAC转基因和较长启动子构建支持缰核表达的调控域内进一步紧凑化的过程，而ano2位点则展示了在结构复杂、重复序列丰富的基因区域中定位候选序列的能力。F0嵌合表达模式符合瞬时Tol2报告试验的特点，F1稳定遗传和高度可重复的表达为构建的调控活性提供了更强证据。作者也讨论了当前工作的局限，包括验证位点数量有限、两个600 bp区间合并后无法区分各自贡献、以及尚未与内源基因表达进行直接共定位，未来需要更大规模候选集、无偏全基因组筛选、单个区间拆分测试和哺乳动物系统验证。
结论认为，本研究整合发育表达图谱、ZEN-former指导的调控谱预测和斑马鱼转基因分析，从gng8和ano2位点中筛选出紧凑候选CRE；两个约1.2 kb构建体均能驱动高度特异、稳健且可种系传递的缰核报告基因表达。所得紧凑CRE和稳定转基因品系为标记和研究斑马鱼缰核环路提供了新的遗传入口，并概念验证了利用长序列深度学习模型进行细胞类型特异性调控预测，从而将大基因组区域转化为紧凑且经实验验证的调控工具。
