视黄醛转运蛋白二聚体变体的异质性结构与致病特性

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Heterogeneous Structural and Pathogenic Properties of Transthyretin Dimeric Variants

　　

摘要

转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）是由转甲状腺素蛋白（TTR）聚集物沉积引起的。虽然从天然四聚体解离出的不稳定TTR单体被认为是ATTR的主要淀粉样前体，但其他中间体（如二聚体和多聚体）的病理作用仍不清楚。本研究旨在表征两种已知主要以后二聚体形式存在的疾病相关TTR变异体——A19D和S112I。我们采用生化和生物物理分析方法证明，A19D和S112I形成富含β折叠的稳定二聚体结构，但表现出不同的结构稳定性和聚集倾向。通过核磁共振（NMR）波谱和小角X射线散射（SAXS），我们揭示了这些二聚体采取异质性的结构构象，而非均匀的二聚体状态。值得注意的是，A19D表现出高度不稳定且具有淀粉样变性的二聚体中间体特征，而S112I则形成更为稳定的二聚体，具有局部无序区域，并表现出与单体TTR相似的展开行为。综合而言，我们的研究结果强调了TTR聚集过程中非天然二聚体的结构异质性，并为它们在ATTR中的潜在作用提供了见解。

引言

转甲状腺素蛋白（TTR）是甲状腺激素的主要转运蛋白，同时通过与视黄醇结合蛋白结合也充当视黄醇的载体[1]。在人体内，TTR主要在肝脏、脉络丛和视网膜色素上皮中合成，并分泌到血液（3–5 μM）和脑脊液（0.25–0.5 μM）中[2]、[3]。除了其生理功能外，TTR还具有内在的聚集倾向。TTR聚集物的积累和沉积与多种类型的TTR淀粉样变性（ATTR）有关，包括老年系统性淀粉样变性、家族性淀粉样神经病变和家族性淀粉样心肌病[4]、[5]。

TTR是一种分子量为55 kDa、富含β折叠的同源四聚体蛋白，每个原聚体由127个氨基酸组成（图1）。每个单体呈现β三明治样结构，由两个四股β折叠（DAGH和CBEF）组成，在E和F β链之间夹有一条短α螺旋（EF螺旋；图1a）[6]、[7]。四聚体TTR的天然状态以二聚体对二聚体的构型组织（图1b）。与此同时，每个TTR单体通过相邻亚基F链和H链之间广泛的氢键以面对面构型组装成二聚体[8]、[9]。这些二聚体进一步通过涉及AB环和GH环的疏水相互作用以背对背构型结合，形成稳定的同源四聚体结构，其中心有两个甲状腺素结合口袋[8]、[9]、[10]。

完整的同源四聚体TTR解离为不稳定单体，随后单体发生展开和错误折叠，这被广泛认为是TTR聚集过程中的关键步骤。这一步骤通常被称为TTR淀粉样形成的限速步骤[11]、[12]、[13]。目前，已发现超过120种疾病相关的TTR突变，其中大多数已被报道会 destabilize 天然构象，最终导致淀粉样变性[14]。因此，当前ATTR的治疗策略主要集中在稳定天然四聚体结构上，从而防止其解离为易聚集的单体。然而，这些治疗并非治愈性的，仅能减缓疾病进展。因此，开发能够直接靶向聚集中间体的替代疗法仍是该领域亟待解决的问题。

目前，已解析了超过200种野生型（WT）TTR和多种TTR变体的X射线晶体结构，以阐明TTR聚集的机制[15]。然而，大多数结构模型表现出相似的构象，无法解释导致聚集的显著结构扰动。值得注意的是，TTR倾向于以四聚体形式结晶，这使得研究解离后的TTR原聚体（如二聚体和单体）的结构特征变得困难[16]。尽管如此，越来越多的证据支持二聚体和多聚体中间体的存在及其对ATTR的病理相关性。Foss等人利用工程化连接TTR构建体展示了四聚体TTR的解离途径，表明TTR四聚体首先解离为AB和CD二聚体（图1b），随后快速分解为单体[17]。Dasari等人报道，从四聚体TTR解离出的易聚集单体形成了错误折叠的二聚体，而这些二聚体进一步组装成多聚体和原纤维[18]、[19]。Sun等人使用¹⁹F-NMR在TTR聚集过程中观察到错误折叠的四聚体和二聚体[20]。

在淀粉样变的TTR突变中，A19D和S112I变异体与严重心肌病相关，据报道在生理条件下主要以二聚体形式存在[21]、[22]、[23]。此外，这些变异体衍生出的多聚体已被证明对心肌细胞和神经母细胞瘤细胞具有毒性[23]、[24]。然而，这些TTR二聚体的详细生化和结构表征仍然知之甚少。因此，本研究旨在表征这些二聚体种类，重点关注它们的聚集性质和结构特征。

章节摘要

蛋白样品制备

人WT、A19D、S112I和M TTR（F87M/L110M）蛋白，带有6×组氨酸标签，通过pQE30载体在大肠杆菌（Escherichia coli）M15(pREP4)细胞中重组表达和纯化[26]。每个TTR变异体分别转化至M15(pREP4)细胞中，并接种于LB琼脂/氨苄青霉素平板上。在37°C下过夜培养后，取平板上的单菌落接种至100 mL LB培养基中，随后在37°C下过夜培养，再接种至1 L LB培养基中。细胞在

结果与讨论

为研究二聚体TTR种类的不同结构性质，我们在大肠杆菌中表达了人TTR变异体WT、A19D、S112I和单体变异体（F87M/L110M，M TTR [35]）。随后对各变异体进行纯化，并使用SEC分析比较了每个TTR变异体的大小。正如预期，WT TTR最先洗脱（约9.89 mL），随后依次为S112I（10.97 mL）、A19D（11.33 mL）和M TTR（13.28 mL）（图2a）。SEC-MALS分析确认A19D和S112I均以均一

结论

本研究对两种致病性、二聚体形成TTR变异体A19D和S112I进行了全面的生化和生物物理表征，以阐明二聚体中间体在TTR淀粉样变性发病机制中的作用。我们揭示了这些二聚体种类具有不同的结构特征，可能以不同方式参与聚集途径。A19D似乎以异质性的二聚体构象集合体形式存在，具有最低的稳定性和最高的聚集倾向。相比之下，

CRediT作者贡献声明

Wookyung Yu：调查、资金获取。Jin Hae Kim：撰写—审阅与编辑、撰写—初稿、监督、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式分析、数据整理、概念化。?a?da? Da?：调查、资金获取。Sangho Ji：方法论、调查。Hyeon Seok Bak：形式分析、数据整理。Hye-Yeon Kim：撰写—审阅与编辑、调查、资金获取。Jin-Beom Si：撰写—审阅与

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者合理请求获取。

利益冲突

作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

资金支持

本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助[编号NRF-2021K2A9A1A06096295，RS-2025-00463074（J. H. K.）]、韩国基础科学研究院[IBS-R034-D1（Y. H. K.）]、韩国环境部[RS-2023-00230402（W.Y.）]以及土耳其TUBITAK[124N830（?. D.）]共同支持。SAXS数据和部分NMR数据在韩国基础科学研究院（KBSI）江原道中心获得，该中心由韩国国家研究基金会（NRF）资助

竞争利益声明

? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者感谢使用NMR波谱仪于浦项科技大学（大韩民国浦项）以及KBSI江原道中心（大韩民国清州）的SAXS分析服务。

Jin-Beom Si|Hyeon Seok Bak|Hye-Yeon Kim|Jaewan Park|Soyoung Cha|Young Ho Ko|?a?da? Da?|Sangho Ji|Wookyung Yu|Jin Hae Kim

大邱庆北科学院（DGIST）新生物学系，大邱，大韩民国