皮克林乳液组成对连续脂肪酶催化α-蒎烯氧官能化的影响：基于水与深共晶溶剂体系的比较研究

《Biochemical Engineering Journal》：Influence of Pickering emulsion composition on continuous lipase-catalyzed oxyfunctionalization of α-pinene: A comparative study of water- and deep eutectic solvent -based systems

　　

**摘要要点**
• 基于水的Pickering乳液（PEs）会促进环氧化物的水解。
• 基于深度共晶溶剂（DES）的PEs能抑制环氧化物的水解，同时提高PE的稳定性。
• 基于Glyceline的PEs在稳定性和反应性能之间取得了最佳平衡。
• 水基体系与DES基体系之间的酶饱和情况存在差异。
• PE的组成决定了含氧官能化反应的性能。

**引言**
含氧官能化反应构成了有机合成中一大类广泛而基础的重要化学转化，它能够实现向烃类选择性引入含氧官能团，从而获得用于精细化学品、药物、香料和聚合物单体的高价值中间体[1], [2], [3]。其中，烯烃的环氧化是工业上最重要的含氧官能化途径之一，它是合成环氧化物的核心路线，而环氧化物是一类用途广泛、可进一步发生开环、聚合或氧化升级的中间体[4], [5], [6]。传统的含氧官能化技术，包括使用过氧酸的经典Prilezhaev环氧化、矿物酸辅助氧化以及金属催化氧转移体系，虽然高效，但由于其依赖危险氧化剂、原子经济性差、腐蚀性反应条件及产生有害废物流，而引发了严重的关注[7], [8], [9], [10]。这些局限凸显了开发更安全、更可持续且更高效的含氧官能化策略的必要性。

生物催化含氧官能化作为一种颇具前景的替代方案已崭露头角，尤其是在采用绿色氧化剂（如过氧化氢H?O?）并在温和反应条件下进行时[8], [9], [11], [12]。特别是南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）引起了广泛关注，因为它能够经由两步化学-酶催化机理实现含氧官能化（图1）：（i）酶促过氢解——将羧酸过氢解在原位生成过氧酸，随后（ii）通过自发化学反应由过氧酸向烯烃底物转移氧[8], [9], [13]。酶促过氢解遵循丝氨酸水解酶特有的乒乓双底物双产物（ping-pong bi-bi）机理。初始时，CalB的催化丝氨酸残基亲核攻击酰基供体的羰基碳，形成四面体中间体，随后该中间体坍缩生成酰基-酶中间体。然后，过氧化氢作为亲核试剂进攻酰基-酶中间体，导致相应的过氧酸生成以及游离酶再生[14], [15], [16]。在随后的化学步骤中，原位生成的过氧酸通过非酶催化的Prilezhaev环氧化机理与烯烃的碳-碳双键反应。该协同氧转移反应经由环状过渡态进行，生成相应的环氧化物，同时过氧酸被还原为其母体羧酸[7], [17], [18]。此策略避免了直接处理不稳定的过氧酸，提供了一条本质上更安全、更绿色的含氧官能化路线。尽管具备这些优势，CalB介导的含氧官能化在工业适用性上常常受制于酶稳定性差和/或比反应速率低[8], [9], [19], [20], [21]。

为克服这些局限，我们探讨了Pickering乳液（PEs）作为该生物催化路线的替代反应介质。PEs是由固体纳米颗粒稳定的乳液，具有高且长期的稳定性，并已被报道为多相生物催化的高效介质[22], [23], [24], [25], [26]。多相生物催化过程作为将亲水性生物催化剂与疏水性底物分别隔置于不同相中的有效策略，已引起相当大的关注，用于执行涉及此类催化剂与底物的反应[27], [28], [29], [30]。这些过程能够改善底物可得性、减少生物催化剂、底物与产物之间的不良相互作用，并促进原本不兼容的反应步骤的集成[30], [31], [32], [33], [34]。然而，多相生物催化过程也面临固有挑战，包括相间传质限制、由界面相互作用引起的酶失活，以及需要剧烈混合以克服扩散阻力——这可能使生物催化剂暴露于有害的剪切力下[35], [36]。其中若干挑战可通过PEs的纳米颗粒稳定液-液（L/L）界面得到缓解[22], [23]。所得液滴提供了巨大的L/L界面面积，从而缩短扩散距离、降低外扩散传质限制，并在连续操作中表现出高动力学稳定性[37], [38], [39]。此外，纳米颗粒层为酶提供了保护性微环境，使其免受过氧化氢等活性物种的不利影响，从而提升其运行稳定性[40], [41]。

此前对PEs中连续生物催化的研究主要集中于单步酶促转化，如转酯化[22], [23], [24]。在此发展基础上，我们此前的研究利用PE基反应介质，在连续搅拌釜膜反应器（CST-MR）中考察了CalB催化烯烃含氧官能化的第一步酶促步骤（过氧酸合成）[40], [41]。成功实现了过氧乙酸的长期连续合成，表明在该体系中CalB在长时间运行期间保持持续的高稳定性——连续生物催化100小时后，过氧乙酸浓度仍保持在伪稳态值的92%[40]。此外，即使在有机相中过氧化氢浓度很高（高达1685 mM，这是影响酶稳定性的主要因素），PE体系中的脂肪酶B在伪稳态之后仍保留活性。这表明与单有机相体系等其他反应介质相比，酶稳定性得到改善——后者虽据报道可提高酶稳定性，但在相近氧化剂浓度下于达到稳态条件之前即完全失活[41]。此外，在获得83%最高产率的同时，比反应速率达到17.5 mmol·h?1·g?1，约为单有机相介质在相近过氧化氢浓度下所报道值的2.9倍[11], [41]。这些发现证明PEs为酶促过氧酸合成提供了稳健的反应环境，并将该过程拓展至超越单步酶促转化的基础。据此，本工作引入后续的化学环氧化步骤，从而以α-蒎烯为模型底物，考察烯烃在PEs中的完整含氧官能化反应。

通常，PEs以水包油（w/o）或油包水（o/w）体系的形式用于生物催化过程，具体取决于底物与酶的溶解性。然而，水的存在可能促进对水敏感的副反应，尤其是环氧化物的水解，这是由于底物、酶与产物在L/L界面处的相互作用所致[42]。为克服该局限，本工作考察了使用深度共晶溶剂（DESs）作为PEs中替代分散相的可能性。DESs是由氢键供体（HBD）与氢键受体（HBA）混合形成的绿色、可生物降解、低毒性溶剂，所得共晶混合物具有可调的理化性质[43], [44], [45]。与基于水的体系类似，DESs也能形成稳定乳液，包括Pickering乳液，同时提供较低水活度的环境[23]。其独特特性——包括强氢键能力、低挥发性、可调极性以及高生物相容性——使DESs成为生物催化的前景介质，且已成功应用于多种生物催化反应[44], [46], [47]。除预期减少水敏感副反应外，DES基PEs对连续CalB催化含氧官能化过程中酶稳定性、反应性能及乳液稳定性的影响尚需研究。

在本研究基于此前水基PEs中连续酶促过氧酸合成工作的基础上[40], [41]，本工作系统地比较了水基与DES基PEs在α-蒎烯完整连续CalB催化含氧官能化中的应用。研究特别评估了关键组成参数——如纳米颗粒浓度、L/L相比、酶浓度及分散相性质——对反应性能与乳液稳定性的影响。除反应性能外，所提出PE基含氧官能化过程的可持续性与过程经济性意义受到的关注尚有限。因此，本研究纳入了初步的可持续性与技术经济性评估，以评价其环境表现、工程相关性及放大潜力。通过阐明PE组成、界面行为与含氧官能化性能之间的关系，研究结果为连续多相化学-酶催化反应系统的经济化设计、优化与建模奠定了基础。与本研究此前的工作[40], [41]一样，乙酸乙酯（EA）在水基和DES基PEs中均被用作连续相，兼具过剩介质与底物的功能（图1）。

**各部分摘要片段**

**材料**
从德国c-Lecta GmbH购买的南极假丝酵母冻干脂肪酶B（CalB lyo），比活力为58500 TBU/g。乙酸乙酯（ROTISOLV? HPLC级）、乙二醇（ROTIPURAN? ≥99.5%）和尿素（≥99.5%，结晶态）购自德国Carl Roth GmbH + Co. KG。过氧化氢（水溶液中50 wt%）和α-蒎烯（(1S)-(?)，98%，GC级）购自德国Sigma-Aldrich GmbH。甘油（≥99.5%）购自德国Th. Geyer GmbH & Co. KG。氯化胆碱……

**DESs的分配系数**
测定了各DES与乙酸乙酯之间过氧化氢的分配系数，以确保所制备PEs有机相中过氧化氢的浓度在实验开始时等于进料溶液中的浓度。乙酸乙酯中的浓度通过HPLC分析测定，而DES相中的浓度则采用式1计算，以最大限度降低稀释误差。如图3所示，Glyceline、Ethaline和Reline的分配系数……

**结论**
Pickering乳液（PEs）为多相生物催化提供了可持续平台，为依赖苛刻条件和氧化剂的传统含氧官能化过程提供了替代方案。在基于水基PEs进行过氧酸合成的先前工作基础上，本研究将该方法拓展至α-蒎烯的完整含氧官能化，整合了酶促过氢解与Prilezhaev环氧化，并阐明了PE组成在决定反应性能方面的作用……

**CRediT作者贡献声明**
Mariam Girgis Meguid Magdi：撰写——初稿，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理。
Anja Drews：撰写——审稿与编辑，监督，资源提供，方法论，经费申请，形式化分析，概念化。
Lemuel Onoriode Adomi：撰写——初稿，软件，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理，概念化。

**利益冲突声明**
作者声明不存在利益冲突。

**致谢**
感谢德国研究基金会（DFG）作为BioOxy项目（项目编号495312945）的一部分为本研究提供资助。作者亦感谢德国学术交换服务处（DAAD）资助Mariam Girgis Meguid Magdi在柏林应用技术大学（HTW Berlin）的研究访问。作者感谢Wacker Chemie GmbH提供二氧化硅纳米颗粒。作者感谢Cinzia Draeger在若干实验开展方面提供的协助。

**符号说明**
A [m2]：面积
CH?O? [mol·L?1]：过氧化氢浓度

Lemuel Onoriode Adomi | Mariam Girgis Meguid Magdi | Anja Drews