《Biochemistry and Biophysics Reports》：Development of long-term oyster explant cultures enable sustained tissue-specific activity and reveal novel cellular behaviours
编辑推荐：
软体动物在生态和经济上均具有重要意义，然而由于缺乏可靠的细胞培养系统，对其细胞生物学的认识进展一直受限。在本研究中，研究人员建立了来自欧洲扁牡蛎（Ostrea edulis）心脏、内脏团、外套膜和鳃等多个组织的可重复的长期体外（in vitro）和离体（ex
软体动物在生态和经济上均具有重要意义，然而由于缺乏可靠的细胞培养系统，对其细胞生物学的认识进展一直受限。在本研究中，研究人员建立了来自欧洲扁牡蛎（Ostrea edulis）心脏、内脏团、外套膜和鳃等多个组织的可重复的长期体外（in vitro）和离体（ex vivo）培养。外植体组织在超过两个月内保持完整并表现出组织特异性功能，其中完整心脏维持节律性收缩长达九个月。培养体系揭示了细胞可塑性，包括血细胞（haemocyte）颗粒周转、伴有新型纤毛形成的心耳上皮重塑，以及多细胞微组织的出现。以往研究不足的细胞类型，包括内脏团脂肪细胞和外套膜肌细胞，在培养中得以维持，扩大了体外可及的细胞谱系。这些系统为未来软体动物研究提供了一个易于操作的平台，同时为比较无脊椎动物细胞生物学以及未来开发软体动物永生化细胞系奠定了基础。
研究背景：细胞培养体系是连接个体生物学与细胞生物学的关键工具。软体动物种类超过86000种，在生态和全球水产养殖中极为重要，但缺乏稳定可重复的细胞培养体系，长期制约了免疫、应激生理、生物矿化（biomineralization）及疾病管理等研究。目前常用的血细胞虽易获取，但寿命短且终末分化，难以用于长期研究；重复分离还会引入个体间差异。此前仅有两例软体动物长期培养系统，且多依赖胚胎或幼虫来源，物种代表性有限。昆虫细胞系和海绵细胞系的成功表明海洋无脊椎动物细胞系可以实现。欧洲扁牡蛎（Ostrea edulis）兼具养殖价值，又易受Bonamia spp.等病原影响，同时是欧洲牡蛎礁恢复的旗舰物种。因此，研究人员建立了标准化培养方法，旨在长期维持并表征该物种多种组织的外植体培养。该研究发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。
主要技术方法：研究采用组织外植体（explant）培养法，从成年O. edulis分离心脏、外套膜、鳃和内脏团，在统一基础培养基中维持；利用活细胞相差及延时成像追踪细胞行为；利用H&E、Masson三色、Alcian蓝、PAS、Perls' Prussian Blue、Masson Fontana和甲苯胺蓝等组织化学染色评估组织结构和细胞特征；通过Histogel包埋对外植体脱落细胞进行细胞学鉴定；心脏收缩频率采用重复测量方差分析（ANOVA）比较。研究基于三年内多次独立培养尝试评估污染率和可重复性。
研究结果：
2.1 完整心脏的离体培养：通过离断心耳与心室连接血管并保留周围组织建立全心脏培养。心脏外植体可维持节律性收缩长达9个月，约14天后进入稳定适应期；换液后收缩频率显著高于换液前，且该反应在整个培养期间保持稳定。组织学显示培养3个月后心耳外膜出现非天然纤毛区域，心室肌保留横纹并更致密，胶原沉积随培养时间增加；颗粒细胞仅存在于心耳而非心室。长期培养中还出现透明样小球及具有自发收缩能力的多细胞微组织。
2.2 血细胞体外动态行为：新鲜血淋巴中可见透明细胞样和颗粒细胞样两类形态，但长期培养中外植体脱落细胞主要为颗粒细胞样群体。活细胞成像显示单个颗粒细胞可在12分钟内失去特征性颗粒而呈现无颗粒表型，无颗粒细胞也可在不到1分钟内获得颗粒，表明血细胞颗粒状态具有高度动态性。新鲜和培养血细胞中还观察到双叶、三叶及多叶核等异质性形态。
2.3 培养组织中的细胞多样性与生物矿化潜力：成纤维样细胞被分为五种形态类型，其中部分类型仅见于心脏培养或呈现心肌细胞样排列。外套膜和鳃培养中出现带活动纤毛的脱落细胞；外套膜在去污染后约两周重新形成纤毛上皮区域，并观察到黏液分泌和肌细胞释放。内脏团培养主要脱落非贴壁脂肪细胞，可维持长达7个月。多种组织培养物中均出现壳样矿化结构，而对照组未见，提示其形成与外植体组织存在相关。
2.4 交叉性培养挑战：污染主要发生在外植体建立后24小时内；鳃外植体污染率约为30–40%，心脏外植体低于5%；所有闭壳肌外植体均在24小时内出现持续性细菌污染而无法维持，因此被排除。约75%成功建立的外植体达到本研究所记录的最长培养时间。另有一类小非贴壁细胞无法明确鉴定为血细胞或其他细胞类型。
讨论与结论：统一培养基体系允许跨组织比较，并支持心脏和内脏团最长维持。心脏约14天的适应期表明，外植后立即测量的功能指标可能反映急性反应，而非稳定状态。与其他软体动物心脏培养相比，本研究在延长培养寿命的同时保留了完整器官结构。心耳来源颗粒细胞和多细胞微组织是心脏培养中的独特发现，但其来源和功能尚不清楚。心耳外膜出现非天然纤毛、细胞外基质重塑及透明样小球表明长期培养伴随组织可塑性或适应性变化。血细胞颗粒的快速丢失和再获得提示培养条件下血细胞表型高度可塑。矿化样结构在多种组织中出现，提示软体动物矿化活性可能不限于外套膜。局限性包括基于形态学的细胞鉴定模糊、闭壳肌培养失败以及缺乏分子标记；未来需通过分子表征、谱系追踪和组织特异性条件优化来进一步验证。总体结论是：这些长期外植体培养系统为软体动物研究提供了易操作的平台，为比较无脊椎动物细胞生物学以及未来建立永生化软体动物细胞系奠定了基础。
