《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Self-assembled cationic lipopeptides modulate membrane interactions, cellular uptake, and mitochondrial dysfunction in HeLa cells
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•阳离子脂肽表现出与结构相关的细胞系反应。•化合物4在HeLa/HEK293细胞中的存活率表现最佳。•化合物1在3小时时的溶血作用较低，但在24小时后增加。•HeLa细胞显示出的脂肽相关荧光比HEK293细胞更强。•PRWG脂肽诱导了与凋亡相关的线粒体功能障碍。引言癌症仍然是全球
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阳离子脂肽表现出与结构相关的细胞系反应。
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化合物4在HeLa/HEK293细胞中的存活率表现最佳。
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化合物1在3小时时的溶血作用较低，但在24小时后增加。
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HeLa细胞显示出的脂肽相关荧光比HEK293细胞更强。
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PRWG脂肽诱导了与凋亡相关的线粒体功能障碍。
引言
癌症仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一，开发出既能提高对肿瘤细胞的选择性又能减少对健康组织不良影响的治疗策略仍然是一个重大挑战[1]。传统的治疗方法，包括手术、化疗和放疗，在临床实践中仍然被广泛使用，无论是单独使用还是联合使用；然而，它们的效果可能会受到非特异性毒性、肿瘤选择性差、药物耐药性和全身副作用的限制[2]。在这种情况下，能够优先与癌细胞相互作用并激活调控性细胞死亡途径的分子和超分子平台作为传统化疗药物的替代品或补充品，受到了越来越多的关注[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]。
在线粒体这个细胞内靶点中，线粒体在癌细胞的新陈代谢、生物能量产生、生物合成、氧化还原调节和程序性细胞死亡中起着核心和多功能的作用[9]。线粒体功能障碍，包括线粒体膜电位的丧失和线粒体细胞死亡信号通路的激活，可以触发与凋亡相关的途径，因此成为抗癌材料设计中的一个重要目标[10]。促进线粒体膜扰动或去极化的策略可以促进与凋亡相关的细胞死亡，特别是当与能够高效进入细胞并进行细胞内定位的分子系统结合使用时[11]。
基于肽的两亲分子因其分子结构能够整合生物降解性、可调电荷、生物活性肽基序和超分子自组装成定义明确的纳米结构，而成为抗癌生物材料设计的有希望的候选者[12]、[13]。它们的两亲性质使得它们可以结合一个疏水段（促进聚集和膜相互作用）和一个肽序列（提供水溶性、生物功能性和分子识别能力）[13]。根据其化学结构，这些系统可以通过非共价相互作用（包括静电相互作用、氢键、范德华力和π–π堆积）形成稳定的纳米结构[14]、[15]、[16]、[17]。这些超分子特性尤为重要，因为大小、形态、表面电荷和稳定性可以影响细胞的摄取、膜扰动、细胞毒性和细胞内运输[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。
脂肽是一类由短肽序列与一个或多个疏水烷基链连接而成的肽类两亲分子[23]、[24]、[25]、[26]。这种分子结构有利于在水介质中的自组装，并且与生物膜之间的相互作用比非脂质化的肽段更强[14]。特别是阳离子脂肽由于其正电荷残基（如精氨酸和赖氨酸）可以与肿瘤细胞膜上富集的负电荷成分（如磷脂酰丝氨酸、糖胺聚糖和其他阴离子表面基团）发生静电相互作用而具有吸引力[27]、[28]。此外，含有胍基的残基，尤其是富含精氨酸的基序，可以通过多价氢键、离子配对和静电相互作用促进膜结合、细胞内化和内吞作用[29]、[30]。
脂肽的生物活性不仅仅由电荷决定。相反，它是肽序列、疏水性、脂质化模式、超分子形态和表面功能团的可及性共同作用的结果[14]、[31]。我们研究小组之前的研究表明，短脂肽的结构修饰可以显著影响其自组装行为、物理化学性质和与生物界面的相互作用[32]、[17]、[34]、[35]。特别是，引入单个或双C18烷基链和阳离子肽基序提供了一个有用的平台，用于研究分子结构和超分子组织如何影响生物活性。
在这项工作中，我们研究了四种由我们之前合成并表征的阳离子脂肽：PRWG-C18H37、PRWG-(C18H37)2、PK(GCP)WG-C18H37和PK(GCP)WG-(C18H37)2 [32]。在这些序列中，P、R、W、G和K分别代表的残基是脯氨酸、精氨酸、色氨酸、甘氨酸和赖氨酸，而GCP表示胍基羰基吡咯基团，C18H37代表十八烷基链。选择这些系统是为了评估肽序列、GCP的引入、阳离子特性以及单次或双重脂质化对生物活性的影响。我们在HeLa细胞（一种宫颈癌细胞系）和HEK293细胞（一种非肿瘤细胞系）中评估了它们的细胞毒性。使用人红细胞评估了溶血活性，以初步评估短期血液相容性。通过使用装载香豆素-6的脂肽组装体研究了细胞摄取和细胞内定位，而细胞死亡机制则通过Annexin V/7-AAD染色和线粒体膜电位测定进行了检测。本研究旨在建立脂肽自组装、细胞结合/内吞、细胞系依赖的细胞毒性反应以及与凋亡相关的线粒体功能障碍之间的结构-活性关系。
章节片段
化学试剂
肽合成的固体支持物使用了2-氯三苯甲基氯树脂。偶联反应使用了Boc-Pro-OH（Sigma-Aldrich，≥98.0%）、Fmoc-Arg(Pbf)-OH（Sigma-Aldrich，≥98.0%）、Fmoc-Trp(Boc)-OH（Sigma-Aldrich，≥97.0%）、Fmoc-Lys(Alloc)-OH（Sigma-Aldrich，≥98.0%，HPLC级）、PyBOP（苯并三唑-1-氧基三吡咯烷磷onium六氟磷酸盐）和DIEA（N,N-二异丙基乙胺），在DMF（二甲基甲酰胺，Sigma-Aldrich，≥99.8%）和DCM（二氯甲烷）中进行。
自组装脂肽的分子设计和物理化学性质
本研究的四种阳离子脂肽PRWG-C18H37（1）、PRWG-(C18H37)2（2）、PK(GCP)WG-C18H37（3）和PK(GCP)WG-(C18H37)2（4）被选为模型系统，以评估肽序列、阳离子基序、脂质化模式和表面电荷对生物活性的影响（图1）。这些化合物之前已由我们的团队使用基于Fmoc的固相肽合成方法合成并进行了表征，随后通过与...
结论
本研究表明，自组装阳离子脂肽的生物活性受到肽序列、脂质化模式、超分子组织和表面电荷的显著调节。所研究的脂肽以浓度依赖的方式降低了细胞活力，在测试条件下，某些系统在HeLa细胞和HEK293细胞中表现出不同的反应。在所评估的化合物中，PK(GCP)WG-(C18H37)2的表现最为理想...
CRediT作者贡献声明
Karina A.B. Argüello:撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究，正式分析。Carlos E. de Castro:撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究，正式分析。Ana A. Zaneli:方法学，正式分析。Sandra V. Vassiliades:方法学，正式分析。Andrea M. Aguilar:方法学，研究，正式分析。Barbara B. Gerbelli:撰写 – 原始草稿，方法学，研究，正式分析。Fernando C. Giacomelli:撰写 –
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP，巴西；资助编号：2022/14753-0、2021/12071-6和2024/00989-7 – CEPID CEMol）、国家科学技术发展委员会（CNPq；资助编号：305574/2023-0）以及国家生物分析技术研究所——Lauro Kubota（INCTBio-LK；CNPq资助编号：408338/2024-5和FAPESP资助编号：2025/26623-1）的支持。此外，这项研究还得到高等教育协调机构的部分资助。
Karina A.B. Argüello|Carlos E. de Castro|Ana A. Zaneli|Sandra V. Vassiliades|Andrea M. Aguilar|Barbara B. Gerbelli|Fernando C. Giacomelli|Wendel A. Alves
