用于增强支架植入后血管愈合的自组装、无载体环化趋化素 9/单宁酸涂层

《Biomaterials》：Self-Assembled, Carrier-free Cyclic Chemerin 9/Tannic Acid Coating for Enhanced Vascular Healing Following Stent Deployment

　　

**摘要** 血管内支架植入作为管理脑动脉粥样硬化狭窄和预防急性缺血性卒中的关键治疗策略，已逐步获得认可。尽管裸金属支架在临床应用中已广泛使用，但其疗效受到支架内再狭窄（ISR）的限制。药物洗脱支架（DES）被开发用于抑制ISR，并已显示出令人满意的短期临床结果。然而，洗脱药物对内皮细胞的非特异性细胞毒性损害了内皮化过程，从而增加了晚期ISR和支架血栓形成的风险。此外，残留的聚合物载体和偶联剂可能引发持续的高敏反应和炎症。在此，我们开发了一种具有抗炎作用、对内皮友好的支架。单宁酸（TA）/环状趋化素9（C9）改性支架通过逐层自组装方法制备，利用抗炎肽环状C9与多酚TA之间的非共价相互作用。该支架无需聚合物载体或偶联剂即可构建。从TA/C9改性支架中释放的TA和C9协同抑制炎症级联反应，抑制平滑肌细胞增殖和迁移，且对内皮细胞覆盖无不良影响。该设计有效消除了与残留载体和偶联剂相关的慢性炎症。在猪模型中，TA/C9改性支架在增强血管修复和抑制新生内膜增生方面表现出优越的疗效。这些结果表明，TA/C9改性支架代表了一种有前景的策略，有望改善脑血管支架设计的长期预后。

**引言** 脑动脉粥样硬化狭窄是卒中的主要病因，尤其在东亚和南亚地区，约占所有缺血性卒中的50%[1]、[2]。尽管标准化药物治疗是抑制疾病进展的关键策略，但患有症状性颅内动脉粥样硬化狭窄的患者在一年内仍有7.2%至15.1%的卒中复发风险[3]。脑血管支架植入已作为一种可行的治疗手段获得推广，适用于未能从医疗干预中获益的患者。目前，临床实践中主要使用的脑血管支架类型为裸金属支架（BMS），包括镍钛合金支架和钴铬合金（CoCr）支架[4]。然而，植入的BMS会引发过度的炎症反应，刺激平滑肌细胞（SMC）过度增殖，进一步导致新生内膜增生和支架内再狭窄（ISR）[5]。ISR会影响BMS的安全性和治疗效率，并导致急性缺血事件的复发。近期一项研究报告，颈动脉支架植入后，BMS植入患者的有症状ISR发生率为30.4%[6]。药物洗脱支架（DES）包含一层聚合物涂层，可递送抗增殖药物，已被证明可有效降低颅内动脉粥样硬化狭窄患者的ISR发生率（DES为9.5%，BMS为30.2%）[7]。然而，DES的晚期并发症（包括ISR、支架血栓形成和新生粥样硬化，发生时间超过一年）的年度发生率约为2%。该风险随时间累积，影响着大量患者[8]。来自冠状动脉DES的大量数据表明，需对晚期并发症保持高度警惕，其潜在机制主要归因于延迟的内皮覆盖和持续存在的血管壁炎症[9]、[10]。除了BMS观察到的病理生理改变外，DES植入还引入了两种额外的不良过程：（i）洗脱药物（如雷帕霉素和多西他赛）对平滑肌细胞（SMC）和内皮细胞（EC）的非选择性抑制；以及（ii）残留聚合物载体和/或偶联剂引发的持续高敏反应和炎症[11]、[12]。因此，开发一种不含额外聚合物载体或偶联剂、对内皮友好、且能够在支架植入后发挥多重作用抑制ISR的支架，是一种促进血管修复和改善支架长期预后的有前景的方法。

单宁酸（TA）是一种天然存在的多酚类化合物，因其多样的生物医学应用和独特的化学性质而被广泛认可。在药理学方面，TA在不同模型中表现出抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎和抗微生物活性[13]、[14]、[15]。这些特性归因于其结构组分，包括碳-碳双键、酚羟基、没食子酸基团和醌结构[16]。此外，其高密度的酚羟基和连苯三酚结构能够参与多种反应，如Michael加成反应或Schiff碱反应，使其成为生物医学工程中的多功能候选分子[17]。在表面工程策略中，TA的粘附能力可与聚多巴胺相媲美，并在功能多样性方面超越聚多巴胺，如更优的亲水性和成本效益[18]。此外，TA的多价结合能力使其能与聚合物或金属协同整合，促进具有抗菌或催化性能的功能涂层的 designing[18]、[19]。值得注意的是，TA的收敛特性通过多酚-蛋白共组装稳定蛋白-药物相互作用，在保持生物活性的同时延长药物释放动力学[20]。

趋化素及其衍生肽是特殊的内源性化学介质，能够解决炎症问题而不干扰固有免疫[21]、[22]、[23]。在众多趋化素衍生肽中，137个氨基酸的趋化素21-157生物活性最强，其次是趋化素15和趋化素9[24]。我们此前开发了一种趋化素15涂层支架，证明其可加速再内皮化再生，抑制炎症反应和平滑肌细胞过度增殖，并减少新生内膜增生和ISR[25]。然而，残留的聚多巴胺载体和偶联剂可能引发慢性高敏反应和炎症反应。因此，开发具有持续药物释放功能的无载体支架以避免这些副作用具有重要意义。短肽相比长链肽展现出独特的药理学优势，包括成本效益高、结构简单以及化学表征和修饰的可行性更强[26]。由于这些优势，我们在此选择了趋化素9作为支架改性的候选分子。趋化素9（149YFPGQFAFS157）仅含九个氨基酸，保留了趋化素21-157的大部分生物活性，活性仅降低约两倍[27]。趋化素21-157和趋化素9均通过趋化因子样受体1（CMKLR1）在微摩尔水平上表现出相似的生物学效应。CMKLR1在脂肪细胞、巨噬细胞、树突状细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）中表达[24]、[28]、[29]。药效学分析显示，趋化素9对CMKLR1受体具有高亲和力（EC50 = 5 nM），而趋化素21-157的EC50为0.1-0.2 nM[30]。在机制上，趋化素9主要通过多靶点调控血管内细胞来调节血管功能：（i）抑制内皮细胞黏附分子和单核细胞-内皮细胞黏附；（ii）调节白细胞功能和细胞因子释放；以及（iii）抑制VSMC迁移和增殖[31]、[32]、[33]。如前所述，环状趋化素9（C9）通过互补诱变产生。与趋化素9相比，C9具有更高的血浆稳定性，在更低浓度下即表现出增强的药理学活性，且生物学效应相似[34]。

BMS在临床实践中的局限性在于由新生内膜增生引发的ISR。DES已得到开发，并大幅降低了早期ISR的发生率。然而，释放药物导致的延迟内皮化和残留聚合物引发的持续炎症增加了晚期ISR和晚期支架血栓形成的风险。在此，我们开发了一种抗炎、对内皮友好的支架（称为TA/C9改性支架）。TA可牢固粘附于CoCr表面，并通过非共价相互作用与C9结合，确保C9的生物活性并延长其释放时间（图1）。TA/C9改性支架仅使用TA和C9制备，减少了传统抗增殖药物引起的延迟内皮化，并最小化了偶联剂相关的持续高敏反应和炎症反应风险。相应地，将TA/C9改性支架植入猪颈动脉，并展示了其在促进再内皮化、抑制炎症和减少内膜增生方面的疗效。

**分节摘要**

**涂层制备** 钴铬（CoCr）合金基底（苏州Kossel Medtech Co., Ltd.）包括箔片、裸金属支架（长18 mm × 直径2.75 mm）、圆形圆盘（半径16 mm）和方形薄片（边长10 mm），用于后续实验。圆盘和薄片分别用于细胞培养和理化表征。所有基底均经过顺序表面修饰：（1）浸没于1 mg/mL TA（美国Sigma-Aldrich，密苏里州）和0.5 mg/mL……

**TA/C9涂层的制备与表征** 为构建OTA/C9/TA/C9涂层（标记为TA/C9），我们通过固相合成法合成了C9肽。C9肽的纯度通过高效液相色谱法（HPLC）验证，如图S1所示，纯度为96.87%。在固相合成中，氨基酸以线性方式依次接枝，肽合成成功与否可以通过将检测到的分子量（通过质谱检测）与理论……

**结论** 脑血管支架植入可预防脑动脉狭窄患者急性缺血事件的发生和复发。除冠状动脉支架外，BMS在临床实践中仍为主流，但受限于高ISR发生率。目前获批用于脑血管系统的DES面临额外的挑战，包括延迟血管修复和晚期并发症。针对这些问题，我们开发了一种抗炎、对内皮友好的支架。

**CRediT作者贡献声明** 黄燕：可视化、方法学、调查、形式分析。杨宇涵：可视化、验证、方法学、形式分析。李坤仪：资源、调查、数据整理。李嘉瑞：方法学、调查。徐敏：方法学、调查。刘畅：软件、方法学。刘刚：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取、概念化。邱华：撰写——审稿与编辑、可视化、方法学、调查、概念化。徐建国……

**利益冲突声明** 作者声明他们没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

**伦理批准与参与同意** 所有实验方案均经中国动物养护委员会和四川大学华西医院批准（方案编号20220124008）。新鲜全血取自健康成年志愿者，符合四川大学华西医院生物医学研究伦理委员会和四川大学华西医院[方案编号2021审查（第809号）]的伦理标准。

**利益冲突声明** ? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文所述工作的个人关系。

**致谢** 本研究得到国家自然科学基金面上项目（82173175）、四川省科学技术厅项目（2024ZYD0143）、成都市科技局项目（2024-YF05-01275-SN）、成都医学院第一附属医院高层次人才项目（CYFY-GQ66）以及四川省医疗卫生促进研究院（KY2023SJ0036）的资助。

| 兰文 | 李双 | 夏寻 | 黄燕 | 杨宇涵 | 李坤仪 | 李嘉瑞 | 徐敏 | 刘畅 | 刘刚 | 邱华 | 徐建国
成都医学院临床医学学院，成都，610500，中国