《Biomaterials Advances》：Photothermal therapy synergizes with bacterial azurin to suppress CT26 tumor growth
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双温度解耦策略在活细菌平台（PMEA）中的应用
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双温度解耦策略在活细菌平台（PMEA）中的应用 - •
在一种活细菌平台（PMEA）中开发了一种“双温度解耦”策略：42°C的温和加热能够触发高产量的阿祖林（azurin）生成，并在肿瘤核心建立一种促进细胞凋亡的蛋白质储存库，而随后45°C以上的光热消融则能造成致命的热损伤，从而避免与持续蛋白质表达相关的脱靶毒性和代谢负担。
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ECN表面自组装的多巴胺-二甲双胍（PDA@MET）生物膜同时充当一个强大的光热转换器和局部二甲双胍（MET）储存库，克服了传统光敏剂和小分子药物对肿瘤渗透性差的难题，并实现了在肿瘤部位的持续药物释放。
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在热脉冲之前预先积累的阿祖林具有协同的“热敏化”效果——它会损害线粒体完整性并降低肿瘤细胞的凋亡阈值，从而增强光热治疗（PTT）的细胞杀伤效率，超越单纯的超热效应。同时，二甲双胍（MET）通过AMPK通路抑制PTT诱导的PD-L1上调，而ECN的固有辅助作用促进了M1型巨噬细胞的极化并增强了细胞毒性T淋巴细胞的浸润，共同逆转了肿瘤的免疫抑制微环境。
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我们认为这项工作与《Materials Today Bio》的主题非常契合，因为它将生物材料涂层、活细菌工程和免疫调节整合到一个多功能平台上，用于精准癌症治疗。
引言
结直肠癌仍然是全球癌症相关死亡的主要原因之一。虽然手术切除结合化疗是标准的治疗方法，但长期用药常常导致化疗耐药性和严重的系统性毒性，这凸显了迫切需要替代治疗手段[1],[2]。光热治疗（PTT）作为一种有前景的微创方法，利用光敏剂将近红外光转化为局部热量，实现具有时空可控性的精确肿瘤消融[3],[4]。然而，PTT的效果受到两个相互关联的生物学障碍的严重限制：PTT会在肿瘤微环境中触发急性炎症反应，提高IFN-γ水平，上调肿瘤细胞上的PD-L1表达，促进免疫逃逸[5],[6]；亚致死的热应激会快速上调存活肿瘤细胞中的热休克蛋白（HSPs）[7]，这些HSPs作为分子伴侣稳定错误折叠的蛋白质并提高凋亡阈值，从而使肿瘤细胞获得热抗性，促进局部复发[8],[9]。
活微生物，特别是ECN，由于其天然的肿瘤定向能力和深层组织穿透能力，越来越受到作为活体治疗平台的关注[10],[11],[12]。与传统纳米药物不同，后者受到致密细胞外基质和高间质压力的阻碍，无法深入肿瘤核心，而ECN会主动迁移到缺氧的肿瘤微环境中并定植[13],[14]。此外，ECN可以通过基因编程成为一个“活工厂”，在外源性刺激下原位生产治疗性蛋白质。除了作为活体递送载体外，ECN本身还具有内在的免疫调节特性，其表面的脂多糖（LPS）和鞭毛蛋白可以通过TLR4信号通路激活免疫反应，诱导巨噬细胞向促炎M1表型极化[15],[16]，从而触发宿主的免疫反应，在肿瘤微环境中有效激活局部抗肿瘤免疫。
阿祖林是一种含铜的氧化还原蛋白，来源于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa[17],[18]。由于它能优先进入癌细胞并通过细胞色素释放诱导线粒体凋亡，因此成为一种有前景的抗肿瘤剂。值得注意的是，与传统的化疗药物不同，阿祖林可以主动破坏线粒体膜电位，降低细胞凋亡的阈值，使其成为与PTT协同作用的理想“热敏剂”[19],[20]。然而，通过基因工程细菌持续表达阿祖林会带来重大的生物安全风险，因为不受控制的蛋白质生产可能会给细菌的代谢系统带来负担，影响其适应性和定植效率，并可能在肿瘤定位之前引发全身毒性[21],[22]。为了解决这个问题，已经开发出了多种可诱导系统，如缺氧诱导型启动子（HIPs），例如nirB和pPepT，这些系统可以利用实体肿瘤的缺氧微环境[22],[23]。然而，这些系统在常氧条件下存在基础活性泄漏和动态范围不足的问题，导致在异质性肿瘤中治疗效果不佳。因此，迫切需要开发一种高度稳健、背景噪音低且可外部控制的可诱导系统，能够在肿瘤部位精确、按需生产蛋白质。
在这项工作中，我们通过用负载有二甲双胍（MET）的多巴胺（PDA）层涂覆ECN，并引入一个热诱导的阿祖林表达电路，构建了一个多功能活体治疗平台（PMEA）。PDA层具有双重作用：（i）在808纳米激光照射下实现强大的光热转换；（ii）作为MET储存库，在肿瘤部位实现局部、持续的药物释放。更重要的是，我们将热刺激分为两个功能不同的阶段：PMEA被编程为在42°C的温和热刺激下释放阿祖林，这种温和加热能够保持细菌的存活能力；随后立即进行45°C以上的中等功率消融，对肿瘤造成致命的热损伤。同时，PMEA抑制PTT诱导的PD-L1上调，逆转免疫抑制微环境[24],[25]。PMEA通过三种协同作用实现强大的抗肿瘤效果：光热消融、MET介导的免疫恢复和阿祖林增强的化学敏感性。这种结合PTT和阿祖林的协同策略为细菌在癌症治疗中的应用提供了新的范例（图1）。
章节片段
PMEA的构建与表征
PBV220质粒从Gen Script购买，使用Takara Plasmid Extraction Kit进行质粒纯化。阿祖林蛋白的基因序列由Qing Ke Biotechnology合成，然后使用无缝克隆试剂盒将阿祖林基因序列与PBV220在BamHI和EcoRI限制位点连接。将PBV220-azurin构建体引入ECN。使用含有50μM卡那西林的Carb50琼脂平板筛选阳性克隆。
PMEA的构建与表征
DA在碱性条件下可以自发氧化聚合形成黑色PDA纳米颗粒，这些颗粒能高效地将光能转化为热量，用于肿瘤细胞的光热消融[26],[27]。为了成功将MET封装在ECN表面，首先将MET和ECN混合在TRIS-HCl缓冲液中，通过静电吸附生成不稳定的MET@ECN复合物。随着DA的逐渐添加，PDA在细菌表面自发聚合。
结论
总之，我们通过将多巴胺涂层、MET装载和光热诱导的阿祖林表达电路整合到ECN平台上，开发了一个多功能的活体治疗平台（PMEA）。这一设计实现了三种协同功能：（i）PDA介导的原发性肿瘤光热消融；（ii）MET引发的PTT诱导的PD-L1上调抑制，以对抗免疫逃逸；（iii）时空可控的阿祖林生产。
CRediT作者贡献声明
宁江：撰写——初稿撰写，数据管理，概念构思。 杨一晓：软件开发，数据分析。 张尚：软件开发，数据管理。 冯晓艺：初稿撰写，概念构思。 杨丽娟：撰写——审阅与编辑，资金筹集，概念构思。
利益声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了云南省高等专业学位研究生“高质量课程建设项目”（资助编号：30370103899）和云南省“高层次中医学术领导人才培养项目”（第二批次，资助编号：Yuncai She（2024）No. 103）的财政支持。
