模拟牙周复合体的仿生双层电纺膜用于协同骨与纤维组织再生

《Biomaterials Advances》：Biomimetic bilayer electrospun membrane simulating periodontal complex for orchestrated bone and fibrous tissue regeneration

　　

通过顺序电纺技术成功制备了一种具有差异化拓扑结构的仿生双层引导组织再生（GTR）膜，以模拟天然牙周胶原纤维束。取向排列的PLGA外层作为可靠的物理屏障，实现牙周韧带重建过程中成纤维细胞的有序排列。内层由胶原整合的HA/β-TCP复合相模拟天然骨微环境，高效加速牙槽骨再生。功能梯度的双层结构实现了牙周硬组织和软组织的同步再生，克服了传统GTR膜的单一功能缺陷。

**引言**

牙周炎被认定为全球第六大口腔疾病，被认为是慢性疾病中导致牙齿脱落的首要因素[1]。在牙菌斑生物膜的持续刺激下，牙周微环境稳态被打破，引发牙周附着丧失、牙周韧带破坏和牙槽骨进行性吸收，最终导致牙齿松动及后续脱落[2]。引导组织再生（GTR）已成为牙周炎所致牙周软硬组织缺陷的主要治疗策略[3]。该技术利用屏障膜覆盖骨缺损区域，隔离快速增殖的牙龈上皮及结缔组织[4]。这一策略建立了稳定的成骨微环境，使缓慢迁移的干细胞能够分化为新的牙周骨组织[5]。

目前商业GTR膜仅具备单一物理屏障功能[6]。为克服这一局限，大量膜改性研究致力于将成骨和抗菌性能整合到膜材料中[7]。除膜材料外，牙周炎治疗中的互补材料策略，如功能水凝胶，也正处于积极研发阶段[8]。然而，从牙周组织功能完整性的角度来看，牙周缺损的修复不仅需要实现牙槽骨再生，还需要重建功能性牙周附着装置并恢复天然牙周解剖结构[9], [10]。牙周韧带功能性再生后，新生牙骨质和纤维组织可完全封闭暴露的根面[11]。这抑制了微生物在根面的定殖和粘附，重建了内在的牙周保护屏障，延长了天然牙的存留时间[12]。

牙周韧带作为牙周防御系统的核心组成部分，由高度有序的胶原纤维束组成，其直径范围约为50至500 nm[13]。这些纤维两端分别锚定于牙骨质和牙槽骨，构建出独特的"硬组织-纤维-硬组织"牙周复合体，建立强健的牙周保护屏障[14]。此外，牙周韧带靠近牙槽骨的区域形成梯度矿化的过渡界面，有效缓解应力集中，维持牙周组织的长期结构稳定性[15]。仿生复制牙周韧带的纳米尺度取向纤维、梯度矿化结构和分层异质结构仍然是合理设计功能性牙周再生支架的主要挑战[16], [17], [18]。

在功能方面，GTR膜要求其两个表面具有差异化的生物特性[19], [20]。面向牙龈软组织的外层设计为致密纤维网络，以防止牙龈纤维长入，从而促进天然牙周韧带结构的重建[21], [22]。相反，直接接触骨缺损的内层则具有相互连通且疏松的多孔结构，以促进细胞浸润和物质运输[23]。

电纺技术利用高压静电场将聚合物溶液拉伸成纤维直径可调的连续纳米纤维网络，其形态与天然牙周韧带的胶原原纤维高度相似[24]。在常见可降解纺丝聚合物中，聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸（PLA）和聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）已被证明可通过调节纤维堆积密度制备致密纤维膜[25]。值得注意的是，PLGA的弹性模量与天然牙周韧带相当[26]。此外，通过调节聚合物链结构可精确控制其降解动力学，使PLGA成为GTR膜外层屏障的理想候选材料[27]。

在众多电纺策略中，顺序电纺能够逐步沉积不同的纺丝溶液，制备具有分层结构或连续梯度成分的纤维支架[28]。该方法可精确模拟腱-骨和韧带-骨附着等天然组织的软-硬过渡界面，从而满足牙周梯度界面仿生构建的需求[29], [30]。骨作为高度矿化的人体组织，因胶原纤维的有序排列和矿化纳米晶体的层次组装而表现出优异的机械强度和韧性[31], [32]。为模拟骨细胞外基质微环境，底层采用胶原纤维构建纳米纤维网络，并以无机磷酸钙矿物相作为核心成骨生物活性组分[33]。磷酸钙存在多种晶体形态，包括羟基磷灰石（HA）、无定形磷酸钙（ACP）、磷酸三钙（TCP）和八钙磷酸盐（OCP）[34]。这些变体在溶解度、晶格稳定性和机械强度方面存在显著差异，赋予其多样化的生物医学应用潜力[35]。其中，HA和β-磷酸三钙（β-TCP）在牙周再生中应用最为广泛。然而，单相磷酸钙存在以下局限性：HA具有高结晶度、结构稳定性和低溶解度，可实现长期空间维持，但降解速度过慢[36]。相比之下，纯β-TCP结构稳定性差、溶解度高，导致快速降解损害支架的空间维持能力。因此，制备整合HA和β-TCP的双相磷酸钙复合材料可协同平衡降解行为、结构稳定性和成骨生物活性[37], [38]。

为应对上述挑战，本工作创新性地制备了一种由致密PLGA外层和疏松Col/HA/β-TCP内层组成的双层复合GTR膜。取向排列的PLGA纳米纤维外层作为高效物理屏障，阻断牙龈上皮和结缔组织向骨缺损处的侵袭。内层则采用整合双相磷酸钙（HA/β-TCP）的胶原模拟天然骨基质微环境，显著加速骨再生。同时，电纺双层膜独特的纤维拓扑结构可在缺损边缘提供接触引导，促进牙周韧带纤维的有序再生与重排[39], [40]。得益于两个功能层各自的优势，该双层复合膜旨在实现牙周硬组织和软组织的协同再生（方案1）。本研究采用顺序电纺工艺，在单一连续过程中实现仿生双层膜的一体化制备。具体而言，首先电纺含无机纳米颗粒的胶原纳米纤维作为功能性内层，随后沉积取向PLGA纳米纤维形成屏障外层。所制备的这种新型GTR膜集成了非对称双面功能、良好的结构稳定性和突出的成骨能力。总体而言，这种双层设计为牙周缺损的功能性再生修复提供了一种创新的材料策略。

**材料与方法**

**材料与试剂**

I型胶原（Col）、1,1,1,3,3,3-六氟异丙醇（HFIP）、PLGA（Mn = 80,000 g·mol?1）、HA、β-TCP（粒径 < 0.063 μm）、胎牛血清（FBS）、4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、钙黄绿素和茜素红均购自Sigma-Aldrich（美国）。Dulbecco's改良鹰基培养液（DMEM）和胰蛋白酶购自Gibco（美国）。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购自碧云天生物技术（中国）。罗丹明B 5-异硫氰酸酯（RBITC）标记的鬼笔环肽由[原文此处截断]供应。

**内层胶原膜的结构与力学优化**

SEM图像（图1A）显示，所有制备的胶原膜均由随机分布的纳米纤维构成相互连通的三维网络，模拟了天然人体细胞外基质的结构特征[41]。在掺入HA和β-TCP纳米颗粒后，大量矿物颗粒锚定于纳米纤维主干上。这种颗粒装饰的纳米纤维结构提供了增大的比表面积，有利于[原文此处截断]。

**结论**

本研究制备了一种具有双层拓扑结构的仿生复合GTR膜，以实现牙周硬组织和软组织的协调有序再生。该复合膜采用功能梯度双层结构设计，由致密取向的PLGA纳米纤维外层和疏松的胶原纤维仿生基质内层（嵌有HA/β-TCP双相矿物）组成。外层的PLGA纤维和内层的胶原[原文此处截断]。

**伦理与作者声明**

所有作者均已知悉并同意提交本手稿，不存在关于作者排序或贡献的争议。

**CRediT作者贡献声明**

王宇宁：撰写——初稿，方法论，形式化分析。梁若曦：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，数据整理。翁雨桐：方法论，数据整理。徐舒雨：验证，数据整理。黄琛：撰写——审阅与编辑，监督。冯艳慧芝：监督，方法论，资金获取。

**资金**

本工作得到国家自然科学基金（No. 82301152）和上海浦江人才计划（No. 2021-81）的支持。

**利益冲突声明**

所有作者声明与其他人或组织不存在任何可能不当影响或偏颇本工作的财务和个人关系。潜在利益冲突的示例包括：

- 无受雇关系
- 无顾问关系
- 无股票所有权
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- 无付费专家证词
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