一种用于脑内出血持续递送氨甲环酸和降低活性氧的多功能可注射止血水凝胶

《Biomaterials Advances》：A multifunctional injectable hemostatic hydrogel for sustained tranexamic acid delivery and ROS attenuation in intracerebral hemorrhage

　　

• 采用二元钙盐交联策略（CaCl?/葡萄糖酸钙）设计了一种负载氨甲环酸（TXA）的可注射海藻酸-明胶水凝胶，以实现可控凝胶化和改进的结构均匀性。
• 优化后的配方（A4G4-TXA）表现出仿脑粘弹性、快速原位凝胶化（<1分钟）和优异的注射性，使其能够有效适配腔体，适用于颅内应用。
• 体外研究表明，该水凝胶可加速血凝形成、形成有序的纤维蛋白结构、持续释放TXA（遵循Hopfenberg模型），降低细胞内活性氧（ROS）水平，并具有优异的细胞相容性。
• 该水凝胶表现出强促凝血活性和血液相容性，支持纤维蛋白基质的快速稳定。
• 在由穿透性脑损伤（PBI）诱导的大鼠脑内出血模型中，该可注射水凝胶有效控制了出血，并与脑组织整合，未检测到神经炎症和毒性。

引言

脑内出血（ICH），无论发生于术中还是术后，仍然是急诊和择期神经外科手术中最常见的并发症。它通常与严重的神经功能缺损、长期残疾和高死亡率相关。临床数据显示，超过3%的择期神经外科手术病例和多达33%的创伤性脑损伤（TBI）患者会遭受与关键最初24小时内止血控制不足相关的并发症[1]。除了直接的血管破裂外，出血进展还受到创伤诱发的凝血病（TIC）和纤溶通路病理性激活的驱动[2]、[3]、[4]、[5]。这种高纤溶状态使新形成的血凝块不稳定，尤其是在液体复苏过程中，因此需要对出血部位进行有针对性的干预以稳定出血。

尽管自发性脑内出血和创伤性或穿透性脑内出血具有不同的启动机制，但一旦血液在脑实质内积聚，它们会共享继发性脑损伤的共同通路。持续性出血、继发性微血管破裂、创伤诱发的凝血病和高纤溶可能损害血凝块稳定，并促进血肿或出血病灶扩大，从而增加占位效应、颅内压和对周围组织的压迫[6]、[7]、[8]。除了这种原发的机械性损伤外，凝血酶生成、红细胞裂解以及血红蛋白、血红素和铁的释放促进了活性氧的产生、线粒体功能障碍、小胶质细胞激活和神经炎症信号传导[9]、[10]、[11]、[12]。这些氧化和炎症过程破坏血脑屏障完整性，增加血管通透性，并导致血肿周围水肿[11]、[13]、[14]。同时的离子失衡、谷氨酸稳态受损以及谷氨酸门控受体的过度激活可能进一步导致兴奋性毒性、细胞毒性肿胀和神经元死亡[10]、[15]、[16]。总体而言，这些相互关联的机制会在初始出血损伤后数小时至数天内传播继发性神经元损伤。鉴于持续出血和不稳定的血凝块形成位于多个继发性损伤通路的上游，快速局部控制出血可能有助于限制血肿进展和随后的血液来源的神经毒性。近期的临床多组学分析进一步揭示了脑内出血从发生到再灌注阶段脑脊液中动态的、以脂质为中心的代谢紊乱。此外，实验证据表明，靶向TXNIP/NLRP3介导的细胞焦亡和神经炎症可能改善脑内出血后的神经修复和功能恢复[17]、[18]。

氨甲环酸（TXA）是一种合成的赖氨酸类似物，通过竞争性抑制纤溶酶原与纤维蛋白上赖氨酸结合位点的相互作用来抑制纤维蛋白降解。早期全身给药TXA，特别是在损伤后最初数小时内，与降低出血相关死亡率相关；然而，其临床获益随治疗延迟而减弱[19]、[20]。此外，全身给药不能选择性地使TXA在颅内出血部位富集，并导致广泛的脱靶暴露，引发了关于剂量依赖性神经学和潜在血栓栓塞并发症的担忧。因此，需要局部给药平台以在出血部位维持TXA浓度，同时减少全身药物暴露。

可注射原位形成水凝胶作为局部药物递送平台引起了广泛关注，因为它们能够适应不规则的组织缺损、直接在靶点形成储库，并提供治疗剂的控释[21]、[22]、[23]。先前的研究已证明局部水凝胶系统在缺血性卒中治疗[24]、[25]和脑癌治疗[26]中药物递送的潜力。然而，对于颅内应用，生物材料必须满足几项苛刻的要求，包括快速凝胶化、可注射性、最小侵入性、与软脑组织的机械相容性以及优异的生物相容性[27]、[28]。

近期的研究进一步表明，水凝胶结构可以根据预期的给药部位和治疗时间窗口进行定制。胃酸响应的海藻酸钠/聚天冬氨酸/CaCO?水凝胶实现了黄芩苷或姜黄素的体内原位凝胶化和持续口服递送，从而改善了实验性胃溃疡模型中的胃滞留和治疗效果[29]、[30]。在神经应用方面，一种PLGA纳米粒子透明质酸水凝胶在体外延长了艾司氯胺酮的释放至少21天，并在局部脊神经根给药后维持了至少14天的镇痛活性[31]。尽管这些系统针对不同的病理状况，但它们共同说明了受调控的钙介导凝胶化和复合水凝胶载体如何改善局部药物滞留并调节释放动力学以适应预期的治疗窗口。

在过去几年中，海藻酸和明胶被选为可注射基质的互补组分，因为它们的组合将温和的离子凝胶化和物理化学可调性与具有生物学意义的细胞-基质相互作用集成在一起。海藻酸是一种由甘露糖酸和古洛糖酸残基组成的亲水性阴离子多糖，通过钙介导古洛糖酸富集区的配位形成高度水合的网络。其聚合物浓度、嵌段组成、分子量和钙可用性可以进行调节，以控制凝胶化、粘度、溶胀、孔隙率、分子运输和粘弹性行为[32]、[33]、[34]。然而，未修饰的海藻酸缺乏内在的哺乳动物细胞粘附配体，单独使用时可能提供有限的生物学识别能力。明胶是一种变性胶原衍生物，通过引入整合素识别的粘附序列（包括含RGD的基序）来补充海藻酸，从而改善细胞粘附和细胞外基质样生物活性[32]、[33]、[35]。它还增加了网络的柔韧性，并通过胶原酶和基质金属蛋白酶实现酶促重塑。相反，单独的明胶在生理温度下表现出有限的结构稳定性，而海藻酸则有助于钙响应的网络形成和形状保持。因此，结合这些聚合物可以提供一种高度水合且具有生物相容性的复合材料，其中海藻酸主要贡献可控的凝胶化和结构支撑。同时，明胶增强了细胞-基质相互作用、基质重塑和生物学功能。明胶相可以发生酶切，而离子交联的海藻酸网络可能通过钙交换、去交联、溶解和聚合物链降解而逐渐崩解，为网络生物降解提供了互补的途径[32]、[34]、[36]。这些特性与神经组织工程相关，因为脑组织是柔软的、富含水分的且具有粘弹性的。因此，可注射海藻酸-明胶基质可以适配不规则的颅内缺损。它们可以进行成分调节，形成机械相容的、细胞外基质样微环境，适合局部治疗递送和神经组织保存[35]、[36]、[37]、[38]。在可注射和响应性生物材料方面的最新进展，包括聚两性离子润滑剂、基于MXene的响应性水凝胶和生物自适应物理水凝胶，进一步说明了如何将可注射性、生物相容性、刺激响应性和动态组织适应集成在一起，以改善局部治疗性能[39]、[40]、[41]。

离子交联是一种有吸引力的凝胶化策略，因为它避免了苛刻的紫外线或有毒的化学引发剂[42]、[43]、[44]。海藻酸基系统被广泛用于此目的；然而，传统的氯化钙（CaCl?）交联通常导致脆性网络和快速、不可控的凝胶化速率，可能损伤脆弱的神经组织[45]。虽然已探索了基于纳米材料的强化策略[46]，但关于此类添加剂长期神经毒性的担忧依然存在。为解决这些局限性，我们使用由CaCl?和葡萄糖酸钙组成的二元离子交联系统，设计了一种多功能海藻酸-明胶水凝胶。通过整合两种具有不同离子释放特性的钙源，该策略旨在调节凝胶化动力学、改善可注射性，并建立与脑组织机械特性更加匹配的流变学特性。在本研究中，我们系统地研究了负载TXA的二元水凝胶的物理化学行为、释放特征和止血性能。我们假设，这种优化的水凝胶网络将提供持续的局部抗纤溶活性，同时提供一个机械相容的、仿脑的基质，有利于组织保存和恢复。我们还考察了其减轻氧化应激（继发性损伤的一个组成部分）的能力。方案1展示了ICH后局部出血稳定的制备策略和潜在机制。

材料片段

材料

本研究所使用的全部材料包括：海藻酸钠、A型明胶（来自猪皮，300度 Bloom）、氨甲环酸（TXA）、二水合氯化钙、一水合D-葡萄糖酸钙、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、37%甲醛溶液、吖啶橙、碘化丙啶、二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）和Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS），均购自Sigma Aldrich（美国）。 ninhydrin（ ninhydrin）、钠

负载TXA海藻酸-明胶水凝胶的设计与制备

合成有效的颅内止血水凝胶需要对交联动力学和机械弹性进行精确控制。我们的方法基于海藻酸-明胶杂化基质，通过双离子交联策略来设计其物理化学结构。如图1a所示，水凝胶网络的形成依赖于二价Ca2?离子与羧酸基团的配位，建立稳定的"蛋箱"模型[60]。其固有的性质

结论

本研究证明了成功开发了一种生物相容性好、成本低且高效的注射海藻酸-明胶水凝胶，用于脑内出血（ICH）的局部管理和快速稳定。通过利用二元离子交联策略（CaCl?和葡萄糖酸钙），A4G4-TXA系统有效克服了传统单盐凝胶化的局限性，实现了与软脑组织某些特性相容的粘弹性特征，

CRediT作者贡献声明

Ali Golkar：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，调查，形式分析，数据整理，概念构思。Hadi Tabesh：监督，方法学，数据整理。Amin Jahanbakhshi：形式分析，数据整理。Razieh Hajisoltani：方法学，数据整理。Ali Poorkhalil：方法学，数据整理。Farhad Ahmadi：写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，可视化，验证，概念构思。

利益冲突声明

作者没有相关的财务或非财务利益需要披露。

致谢

本出版物中报道的研究得到了伊朗医科大学的支持，资助编号为25107。

Ali Golkar | Hadi Tabesh | Amin Jahanbakhshi | Razieh Hajisoltani | Ali Poorkhalil | Farhad Ahmadi