黏蛋白水凝胶纤维实现两歧双歧杆菌与肠上皮细胞的限氧共培养

《Biomaterials Advances》：Mucin hydrogel fibers enable oxygen-limited co-culture of Bifidobacterium bifidum and intestinal epithelial cells

　　

•以聚乙二醇（PEO）为可移除纺丝助剂，通过静电纺丝法制备了以黏蛋白为主的凝胶纤维。
•交联后的纤维表面保留了检测的Core-1 O-连接聚糖表位。
•两歧拟杆菌（B. bifidum）能够黏附、增殖于该纤维上，并在纤维存在的情况下生长。
•矿物油覆盖层加上Caco-2细胞的呼吸作用降低了上皮层下方的氧含量。
•该系统实现了无需微流控器件的Transwell共培养方案，用于培养两歧拟杆菌和Caco-2细胞。

1. 引言

眼睛、鼻子、口腔、肺部和胃肠道等器官的上皮组织表面覆盖着一层黏液层[1]、[2]。黏液层起到润滑作用，并保护宿主免受病原细菌和病毒的侵害[3]、[4]。特别是在胃和肠道中，黏液层不仅作为物理屏障发挥作用，还作为肠道细菌定殖的锚定支架[5]、[6]。黏蛋白是黏液层的主要成分，是一种由长链核心蛋白修饰了大量O-连接聚糖的糖蛋白[7]，并在组织表面形成网状网络结构[5]、[6]、[8]。近期研究表明，肠道微生物群贡献了多种宿主生理功能，包括脂肪积累、抗炎反应、抗感染保护以及维持骨密度[9]、[10]。同时，越来越多的关注集中在以微生物群为靶点的治疗策略上，包括通过移植正常微生物群来诱导抗炎效应和抑制肿瘤[11]、[12]。因此，肠道微生物群与上皮细胞交汇的黏蛋白界面，无论从基础生命科学还是医学应用的角度来看，都引起了越来越大的兴趣。理解该界面的宿主-微生物相互作用需要一个能够重建该界面的体外模型。

开发肠道宿主-微生物界面的体外平台面临三大挑战。第一个挑战是相互矛盾的氧气需求。许多主要的肠道细菌，包括双歧杆菌属（Bifidobacterium），是严格厌氧菌，需要低氧环境[5]、[6]，而肠道上皮细胞（如Caco-2细胞）则需要与其存活和屏障功能兼容的条件。这些需求必须在同一系统中得到协调。第二个挑战是缺乏模拟黏液的基质。理想的三维基质应能支持细菌黏附和定殖，同时呈现O-连接聚糖[7]，但此类支架并不容易获得。第三个挑战是简便性与生化功能性的结合。肠器官芯片器件功能强大，但需要复杂的仪器且可及性有限[13]。已有报道了更简单的厌氧菌-需氧菌共培养体系，如琼脂包埋形式[14]，但这些体系依赖惰性支架，缺乏呈现聚糖的生化微环境。因此，仍然需要一种兼具限氧功能和基于黏蛋白的基质的可及性平台。

各种基于黏蛋白的材料已被研究作为候选功能性黏液基质，但每种都存在局限性。黏蛋白涂覆于平板表面已被用于形成模拟黏液层[15]、[16]。然而，这些涂层无法控制网状结构，且其结构与生物黏液层不同。其他基于黏蛋白的材料，包括凝胶[17]、[18]、[19]、薄膜[20]和纤维[21]、[22]也已被报道。然而，大多数需要化学修饰或交联，可能改变天然黏蛋白的结构。此外，大多数已报道的黏蛋白材料与聚（乙烯醇）（PVA）和聚（ε-己内酯）（PCL）等合成聚合物混合，而主要由黏蛋白组成的三维多孔聚糖呈现基质实例仍然有限[20]、[21]、[22]。

在本研究中，我们通过静电纺丝猪胃黏蛋白（PGM）/聚乙二醇（PEO）溶液，用戊二醛交联，然后去除PEO（PEO作为临时纺丝助剂），制备了三维多孔黏蛋白凝胶纤维。我们随后检验了该纤维是否保留了O-连接聚糖表位以及是否支持两歧拟杆菌的黏附和增殖。此外，通过将纤维与矿物油介导的限氧供应相结合，我们建立了一个常规Transwell共培养平台，用于培养Caco-2上皮单层和两歧拟杆菌，无需复杂的微流控器件。两歧拟杆菌是一种存在于人体肠道中的严格厌氧益生菌[23]，已知其能取食黏蛋白来源的O-连接聚糖[24]。Caco-2细胞形成紧密连接，并允许通过跨上皮电阻（TEER）定量评估上皮屏障功能。因此，本研究的目标是建立一种基于黏蛋白的限氧共培养平台。

2. 材料与方法

2.1. 材料

猪胃黏蛋白（PGM；日本大阪富士胶片和光纯药工业株式会社）和聚乙二醇（PEO；平均Mv 2,000,000；美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司）用于静电纺丝。戊二醛、亚甲蓝溶液（pH 2.5）、重组镰刀菌（Sclerotium rolfsii）凝集素（rSRL）-生物素以及链霉亲和素-异硫氰酸荧光素（FITC）（日本东京化成工业株式会社，东京，日本）用于聚糖染色。液体石蜡（富士胶片Wako）和矿物油（Sigma-Aldrich）用作限氧覆盖层。抗紧密连接蛋白-1（ZO-1）抗体（#ab216880，英国Abcam株式会社，东京，日本）用于紧密连接染色。两歧拟杆菌JCM1255[25]和Caco-2人结直肠腺癌细胞（RCB0988）购自日本理化学研究所生物资源中心（RIKEN BRC，茨城县，日本）。

2.2. 黏蛋白凝胶纤维的制备与表征

PGM从商业PGM粉末中纯化，方法为：在含有0.05 mol/L二硫苏糖醇（DTT）的0.1 mol/L碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 10.4）中溶解，离心，反复甲醇沉淀，并在减压下干燥。将纯化的PGM和PEO分别溶于反渗透（RO）水中并混合，最终组成为6% PGM和1% PEO。使用纳米颗粒分析仪（SZ-100，日本堀场制作所）在pH 3.5-12下测量0.5% PGM溶液的粒径和Zeta电位。使用流变仪（MCR302，奥地利安东帕公司）在室温下、100-1 rad/s和10%应变条件下测量复数黏度。

在以下条件下，使用商用静电纺丝系统（NANON，日本福冈MECC公司）将PGM/PEO纤维纺丝到覆盖铝箔的旋转收集器上：流速0.8 mL/h；电压20 kV；针头规格27 G；喷嘴到收集器距离13 cm；转速50 rpm；纺丝时间60 min；相对湿度30%；室温。纤维在戊二醛蒸气中过夜交联。交联后，纤维片用2 mL RO水洗涤两次以去除PEO和未反应的交联剂，得到PGM凝胶纤维。使用扫描电子显微镜（SEM；JSM-6390FMM，日本电子，东京，日本；15 kV）观察纤维形貌，并使用ImageJ（版本1.54p）分析纤维直径。通过衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）（Nicolet 6700，美国赛默飞世尔科技株式会社，东京，日本）确认PEO的去除。通过亚甲蓝染色和rSRL凝集素染色（rSRL-生物素（1:200）和链霉亲和素-FITC（1:400））检测酸性糖和Core-1 O-连接聚糖表位。

2.3. 两歧拟杆菌在黏蛋白凝胶纤维上的培养与生长测定

de Man-Rogosa-Sharpe（MRS）培养基（乳酸菌MRS肉汤，美国BD Difco公司）补充0.05%（w/v）盐酸半胱氨酸以及无乳糖、营养受限的改良国际乳杆菌分委员会培养基（m-ILS）[26]，通过氮气吹扫使其厌氧并经高压灭菌。两歧拟杆菌JCM1255在37°C下于MRS培养基中预培养12-16 h。纤维培养时，用70%乙醇处理的PGM凝胶纤维用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，接种预培养菌液，在近似厌氧条件下（使用AnaeroPack系统，日本东京三菱瓦斯化学公司）于37°C下培养最多14天。在第1、3、7、10和14天收集纤维，进行SEM观察以及用rSRL-生物素/链霉亲和素-FITC和Hoechst 33342（细菌细胞核）进行rSRL凝集素染色。生长测定时，将MRS培养基中预培养的细胞离心沉淀，重悬于m-ILS培养基中，在12孔板中有无PGM凝胶纤维的条件下培养48 h。通过测量0和48 h的OD660来定量生长；单独m-ILS培养基作为空白对照。

2.4. Caco-2细胞培养与TEER测量

Caco-2人结直肠腺癌细胞（RCB0988；日本理化学研究所生物资源中心，茨城县，日本）在补充非必需氨基酸、20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的必需氨基酸培养基（MEM）中于37°C、5% CO?条件下维持，70-80%汇合时传代。单层形成时，将细胞以1×10?个细胞/孔的密度接种于12孔Transwell小室（0.4 μm孔径，美国康宁公司）中，培养20-24天。每2天换液一次，直至使用MilliCell ERS-3.0（美国密理博公司）测量的TEER达到稳定平台期。相对屏障保留率计算如下：TEER保留率（%）=（TEER处理后/TEER处理前）×100。

2.5. 限氧培养与共培养系统

使用FireSting GO2点传感器（德国亚琛PyroScience GmbH公司）测量溶解氧，并用空气饱和水和OXCAL脱氧水进行两点校准。对于无细胞条件（无油、液体石蜡和矿物油），传感器点放置于Transwell孔底部。对于上皮条件（矿物油+Caco-2），传感器固定在Transwell膜底部，以测量上皮层正下方的溶解氧。培养基上方覆盖液体石蜡或矿物油以限制顶空氧的流入。对于上皮条件，在细胞层顶端添加200 μL矿物油。溶解氧每2秒记录一次，持续24 h。

氧通过油层的传输根据菲克定律建模，使用氧分压p，假设其在油-水界面处连续：J = -D·S(?p/?z)，其中P = D·S。稳态时，J = P·Δp/L，其中Δp = p_atm，假设细胞耗氧维持基底侧接近零。参数如下：小室面积A = 1.12 cm2；油层厚度L = V/A ≈ 3.6 mm（400 μL）；p_atm = 21 kPa；D分别为：水3×10?? m2/s、液体石蜡2.5×10?1? m2/s、矿物油4×10?11 m2/s（后两者视为通过拟合实测曲线得到的视表体系相关传输系数）；S分别为：水1.0×10?? mol/(m3·Pa)、油4.8×10?? mol/(m3·Pa)；Caco-2耗氧量为5×10?1? mol/(细胞·s)（在1×10?个细胞/cm2时），对应V_max = 5×10?? mol/(m2·s)。实测氧分布曲线与模型拟合进行了比较。

共培养时，将负载两歧拟杆菌的PGM凝胶纤维或细菌悬液放置于成熟的Caco-2单层上，中间有无甲基纤维素层。然后在系统上覆盖矿物油。条件由甲基纤维素的存在与否以及细菌施用方式（纤维黏附或悬浮）定义。细菌以OD660 = 0.05接种，37°C培养后进行分析。共培养基由不含青霉素-链霉素的MEM（含10% FBS）、MRS培养基和无Ca2?/Mg2?的PBS（PBS(?)）按20:10:70的体积比组成，该比例通过TEER筛选确定。

2.6. 共培养后的免疫染色与活性评估

共培养后，用4%多聚甲醛/PBS固定Caco-2单层，封闭后，使用抗ZO-1抗体（1:200）、Alexa Fluor 594标记的二抗和Hoechst 33342对ZO-1和细胞核进行染色。染色样品用荧光显微镜（IX83，日本奥林巴斯公司）观察。共培养后的细菌活性通过将回收的纤维转移至新鲜MRS培养基、重新培养72 h，并测量重新培养前后的OD660进行评估。

2.7. SEM样品制备

为测量膜厚度的截面SEM，将洗涤前的交联6% PGM/1% PEO纤维片在液氮中冷冻并断裂。表观截面厚度可能因冷冻和断裂过程中的变形而被低估。其他SEM样品固定在铝桩上，以15 mA、6 Pa进行离子镀膜，120 s内镀覆Pt/Pd。样品使用JSM-6390FMM（日本电子）在10或15 kV下观察。水洗涤的PGM纤维和培养后回收的纤维通过梯度乙醇系列脱水，转入叔丁醇，冷冻干燥后进行观察。

2.8. 统计分析

数据以均值±标准差表示。除另有说明外，n表示独立生物学重复，定义为独立培养或小室。多组比较采用单因素方差分析后进行Tukey's honestly significant difference事后检验。两组比较采用Student's t检验。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 保留O-连接聚糖的黏蛋白为主的凝胶纤维的制备

单独的PGM水溶液无法静电纺丝成纤维，而是形成液滴。因此加入高度可纺性聚合物PEO作为临时纺丝助剂。由于阴离子PGM的解离和聚集状态随pH变化，我们首先检验了溶液性质和可纺性（图S1、S2）。平均粒径在pH 3.5时最大，随pH升高而减小。Zeta电位在pH 5.5以上为负值，在pH 8-10时达到最低值，等电点约为4。复数黏度在pH 4、7和10时相近，在pH 13时降低，并随PGM和PEO浓度增加而增大。

静电纺丝纤维的SEM分析（图S2）显示pH 4和7时存在珠状结构，而pH 10或13时无珠状结构。pH 10下制备的纤维直径分布最窄且最均匀。5% PGM/1% PEO和6% PGM/1% PEO均产生了均匀、无珠的纤维，平均直径约为400 nm。

因此，我们选择了pH 10条件下的6% PGM/1% PEO用于后续实验。在这些条件下，PGM/PEO溶液通过电纺丝技术在旋转收集器上纺丝形成无纺布状纤维片（图1a–c）。该纤维片经戊二醛蒸气交联并固化，随后用RO水洗涤以去除PEO。交联后未洗涤的PGM/PEO纤维片厚度约为5 μm或更低（图S3）。所得PGM水凝胶纤维保持了多孔的三维非织造网络结构，通过扫描电子显微镜（SEM）可观察到这一点。交联和洗涤后，其平均直径增加至1026 ± 416.5 nm，这与加工过程中细纤维的合并现象一致（图1d–f）。ATR-FTIR光谱（图2a）显示，PEO来源的–CH?吸收带（2885 cm?1）在洗涤后消失，而PGM来源的吸收带在1045 cm?1（COC伸缩振动）、1554 cm?1（酰胺II）和1642 cm?1（酰胺I）处得以保留，表明残留PEO低于ATR-FTIR的检测限。藻蓝染色（图2b）和rSRL-生物素/链霉卵白蛋白-FITC凝集素染色（图2c）分别显示了酸性末端糖的保留以及所检测的Core-1（Gal–GalNAc）O-连接糖链表位的可及性。未添加rSRL-生物素的对照在相同的成像和显示设置下未检测到荧光（图S4）。Core-1结构及其凝集素识别机制如图S1所示。下载：下载高分辨率图像（473KB）下载：下载全尺寸图像图1. PGM水凝胶纤维片的制备。（a）制备方案：将PGM溶液与PEO溶液混合后电纺为PGM/PEO纤维片，经戊二醛蒸气交联并用RO水洗涤去除PEO，得到以黏蛋白为主的（PGM）水凝胶纤维。（b、c）所得纤维片在铝箔上的照片（b）及剥离后的照片（c），显示其可自支撑且易于操作。（d、e）洗涤前（d，PGM/PEO纤维）和洗涤后（e，PGM纤维）的扫描电子显微镜（SEM）图像；洗涤后的纤维仍保持多孔的三维非织造网络。标尺，5 μm。（f）洗涤后PGM纤维的纤维直径分布（均值 ± 标准差，1026 ± 416.5 nm；基于干燥状态下对超过100根纤维的测量）。下载：下载高分辨率图像（247KB）下载：下载全尺寸图像图2. 洗涤后的纤维以黏蛋白为主，并保留所检测的黏蛋白O-糖表位。（a）PGM、PEO、PGM/PEO纤维和PGM纤维的ATR-FTIR光谱。虚线标出了PGM来源的吸收带（COC ～ 1045 cm?1，酰胺II ～ 1554 cm?1，酰胺I ～ 1642 cm?1）和PEO来源的–CH?吸收带（～2885 cm?1）。PEO吸收带在PGM/PEO纤维中存在，洗涤后消失，表明残留PEO低于ATR-FTIR检测限。（b）藻蓝染色（pH 2.5）的PGM纤维，标记酸性末端糖。（c）用重组小核菌凝集素（rSRL）-生物素和链霉卵白蛋白-FITC对PGM纤维进行凝集素染色，检测Core-1（Gal–GalNAc）O-糖结构（绿色）。匹配的明场外观和省略rSRL-生物素的荧光对照见图S4。标尺，50 μm。

3.2. 双歧杆菌黏附于黏蛋白水凝胶纤维并在其上增殖生长

在近厌氧条件下，在PGM水凝胶纤维上培养双歧杆菌，并用SEM进行观察（图3a–e）。从第1天起即可观察到黏附的细菌，大小约为1 μm，并表现出双歧杆菌特征性的Y形形态，且随时间推移逐渐增多。到第10天，密集聚集的细菌已形成类似生物膜的结构（图3d、f）[32]。第14天的凝集素染色（图3g）显示细菌定植于纤维表面并渗透进入纤维片的孔隙，同时保留了糖链信号。

下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像图3. 双歧杆菌黏附于PGM纤维并在其上增殖生长。（a–e）在近厌氧条件下于PGM纤维上培养双歧杆菌的时间序列SEM图像：(a) 第1天，(b) 第3天，(c) 第7天，(d) 第10天，(e) 第14天。第1天即可观察到黏附，到第10天出现逐步增殖和类似生物膜的聚集。（f）第10天的放大SEM图像，显示双歧杆菌特征性的Y形形态。标尺，(a–e) 10 μm；(f) 5 μm。（g）第14天的凝集素染色：纤维的Core-1糖链（rSRL-生物素/链霉卵白蛋白-FITC，绿色）和细菌细胞核（Hoechst 33342，蓝色）；细菌定植于纤维表面并渗透入孔隙。标尺，10 μm。（h）在去乳糖、营养受限的m-ILS培养基中培养48 h后的细菌生长情况（OD???），有纤维（Fiber(+)）或无纤维（Fiber(?)）处理组，以m-ILS培养基单独作为空白对照（均值 ± 标准差，n = 4；单因素方差分析加Tukey HSD检验；*p < 0.05；n.s.，不显著）。

为评估在营养受限条件下添加纤维是否能支持细菌生长，将MRS预培养的细菌重悬于无乳糖、营养受限的m-ILS培养基中，有或无纤维共培养48 h（图3h）。无纤维（Fiber(?)）时，OD???与0 h时的值相比无显著差异。相比之下，有纤维（Fiber(+)）时，OD???显著增加（n = 4；p < 0.05）。该结果表明，在实验条件下纤维的添加支持了细菌生长；但由于未测量降解产物和代谢物，这一结果并不能证明O-糖链的特异性利用。

3.3. 矿物油限制氧气供应并创造局部低氧环境

在肠道中，厌氧管腔紧邻上皮层[34]。为了限制传统Transwell系统中大气氧气的渗入，我们在培养基上方覆盖油层，并测量24 h内的溶解氧浓度（图4a、b）。对于无细胞条件，传感器位于培养皿底部；对于Caco-2条件，传感器紧贴Transwell膜下方。无油覆盖层时，氧浓度迅速接近空气饱和值。液状石蜡和矿物油均能抑制氧气渗入，其中矿物油的效果更为显著。所测得的曲线用氧气通过油层传输的现象学Fick扩散模型进行了拟合（虚线），其中油相传输系数被处理为表观的系统相关量[35]、[36]。

下载：下载高分辨率图像（189KB）下载：下载全尺寸图像图4. 油覆盖层限制氧气供应并降低上皮层下方的溶解氧。 (a) 氧气测量装置示意图，展示上皮条件（矿物油 + Caco-2）下的情况，传感器固定在Transwell膜下方以记录上皮层正下方的溶解O?。对于无细胞条件（无油、液状石蜡和矿物油），点式氧传感器则放置在Transwell培养皿底部（未示出）。(b) 24 h内四种条件下的溶解O?浓度：无油、液状石蜡、矿物油和矿物油加Caco-2。虚线为现象学Fick扩散拟合曲线，其中油相传输系数被处理为表观的系统相关量。在矿物油条件下，O?供应受到限制；当与细胞O?消耗相结合时，上皮层正下方传感器位置的溶解O?浓度降至约0.1 mL/L（约为空气饱和值的2%）。

在矿物油覆盖层下的Caco-2细胞中，细胞的氧消耗超过了通过油层传入的受限氧气供应。在上皮层正下方传感器位置，溶解O?浓度降至约0.1 mL/L，在此条件下相当于约2%的空气饱和值（空气饱和培养基约为4.8 mL/L）。

3.4. 黏蛋白水凝胶纤维实现双歧杆菌与Caco-2上皮单层细胞的共培养

接下来，我们将限氧方法与PGM水凝胶纤维结合，将双歧杆菌与Caco-2细胞进行共培养。Caco-2细胞在Transwell小室上培养，直到跨上皮电阻（TEER）达到稳定平台期，表明成熟的单层细胞已形成（图S7）。然后依次将培养基更换为无青霉素-链霉素培养基和共培养基，并如图5a所示组装共培养装置。共培养基通过基于TEER筛选的MEM/MRS/PBS(?)混合物筛选确定（图S6）。

下载：下载高分辨率图像（589KB）下载：下载全尺寸图像图5. 共培养配置、上皮屏障保留和细菌活力。(a) 共培养装置的时间线和层次结构（从下至上：Caco-2单层细胞、甲基纤维素层、负载双歧杆菌的PGM纤维、矿物油覆盖层），以及四种条件下共培养后TEER值占共培养前值的百分比（有或无甲基纤维素，双歧杆菌以纤维黏附或悬浮方式施加；均值 ± 标准差，n = 5；单因素方差分析加Tukey HSD检验）。甲基纤维素/纤维条件在测试条件下表现出最高的TEER保留率。(b) 共培养后Caco-2单层细胞的ZO-1免疫染色（红色）和细胞核染色（Hoechst 33342，蓝色），显示连续的紧密连接网络。标尺，50 μm。(c) 共培养后纤维的SEM图像，显示黏附的双歧杆菌。标尺，30 μm和5 μm（插图）。(d) 将共培养后的纤维转移至MRS培养基后0 h和72 h的细菌再生长情况（OD???）（均值 ± 标准差，n = 5；Student's t检验），表明共培养后细菌仍保持活力。

共培养后的上皮屏障功能通过改变甲基纤维素的存在和细菌施加方式（纤维黏附或悬浮）进行评估（图5a）。甲基纤维素/纤维条件在测试条件下表现出最高的TEER保留率，而悬浮条件的保留率低于20%。ZO-1免疫染色显示Caco-2单层细胞中存在连续的紧密连接网络（图5b），与在测试条件下屏障保留一致。

共培养后的SEM显示双歧杆菌黏附于纤维上（图5c；图S5）。将回收的纤维转移至新鲜MRS培养基时，在72 h重新培养期间OD???增加（图5d），表明共培养后双歧杆菌仍保持活力。

4. 讨论

4.1. 糖链展示型黏蛋白水凝胶纤维的设计与制备

本研究的核心目标是制备一种展示黏蛋白来源糖链表位的三维多孔纤维。单独的PGM无法进行电纺丝，这与黏度、表面张力和链缠结需落在适合稳定射流形成的范围内这一要求一致[27]。因此，弱缠结的糖蛋白溶液不太可能维持电纺丝。我们使用PEO作为瞬态纺丝助剂，并确定pH 10下的6% PGM/1% PEO为最佳条件。

可纺性的pH依赖性可从PGM的电荷状态来解释。PGM含有酸性糖，包括唾液酸，酸性pH下静电排斥减弱促进聚集[28]、[29]。这一解释与pH 3.5附近更大的粒径和改变的Zeta电位（图S1）以及pH 4和7时形成串珠状纤维（图S2）相一致。5–6% PGM/1% PEO溶液的黏度与先前报道可产生无串珠纤维的PEO溶液的黏度相当[30]，表明pH和浓度依赖的黏度对稳定纤维形成有贡献。

PEO的去除是制备过程中的关键步骤。按照我们之前的核-壳策略，即在纺丝后去除牺牲性聚合物以产生单组分纤维[31]，PGM通过戊二醛交联固化，水溶性PEO被洗涤去除。ATR-FTIR确认了PEO来源吸收带的丧失（图2a），而藻蓝和rSRL凝集素染色显示酸性糖和所检测的Core-1表位在纤维表面仍保持可及性（图2b、c；图S1）。省略rSRL-生物素的对照在匹配的采集和显示设置下未检测到荧光（图S4）。虽然FTIR确认了PEO的去除，但由于戊二醛必然形成共价桥，因此无法排除交联剂来源的结构。交联位点和密度未确定；凝集素结合信号的保留仅表明交联并未消除所检测表位的表面可及性。

残留戊二醛是戊二醛交联生物材料的普遍关注问题。纤维在蒸气交联后经洗涤，在测试的共培养条件下未观察到上皮连接图案的明显破坏（图5b）。然而，残留戊二醛未进行定量分析，细胞毒性也未独立评估；因此现有数据不能确立不存在可释放的残留物或一般的细胞相容性。纤维片厚度约为5 μm或更低。尽管较薄，但它由多层互联纤维网络构成，具有开放孔隙，细菌在网络内部而非仅在其外表面上被观察到（图3g）。

4.2. 黏蛋白水凝胶纤维作为支持双歧杆菌生长的黏附基质

双歧杆菌从第1天起黏附于纤维，到第10天形成类似生物膜的结构（图3）[32]。细菌分布在纤维表面和孔隙内（图3g）。在肠道中，细菌定植于松散的 outer 黏液层，但被排斥于致密的 inner 层和其下方的固有层[5]、[6]、[33]。因此，观察到的渗透进入多孔纤维网络的现象类似于松散黏液层的定植，表明这些纤维可以作为一种类似黏液的定植支架发挥作用。

纤维可能还提供了代谢可及的黏蛋白来源组分。在无乳糖的m-ILS培养基中，仅在存在纤维的情况下发生了细菌生长（图3h）。

## 4.2 B. bifidum 对 O-糖苷的利用（续）

B. bifidum 拥有能够降解黏蛋白来源的 O-糖苷的酶 [24]，并且在交联后 Core-1 糖苷表位仍然可及（图 2c）。这些发现与黏蛋白来源成分仍可被细菌利用的可能性一致。然而，未测量糖苷降解产物和代谢物，且 OD660 的增加并不能证明对 O-糖苷的特异性利用。因此，结果表明仅在测试的营养限制条件下，纤维支持了细菌生长。

未包含惰性合成纤维对照，如交联 PVA 或 PEO 纤维。这类纤维与黏蛋白纤维不仅在营养成分上存在差异，还在表面电荷、亲水性、糖苷呈现方式和溶胀行为等方面有所不同，因此无法分离黏蛋白来源营养素的贡献。解释转而依赖于培养基组成：在无乳糖的 m-ILS 培养基中，交联黏蛋白纤维是唯一添加的大分子底物。由于纤维中不含合成纺丝聚合物，纤维依赖性生长与黏蛋白来源成分的贡献是一致的。这一证据仍然是间接的，直接证明 O-糖苷的利用需要对降解产物进行组成分析或酶学分析。

### 4.3 限氧 Transwell 共培养

矿物油作为扩散屏障，限制了氧气运输，但并非完全阻断。所测量的氧气分布可通过表观 Fick 扩散模型重现，其中油相的传质系数被处理为与实验数据拟合的表观系统相关量（图 4b），这与氧相中氧气传质系数是系统相关有效量的报告一致 [35][36]。在紧邻上皮层下方的传感器位置，受限的氧气流入与 Caco-2 细胞的耗氧作用使溶解氧降至约 0.1 mL/L（约为空气饱和度的 2%）。纤维区域内的氧气浓度未被测量。由于油层构成主要的传质阻力，可推断其下方的水相处于低氧状态，但这一点未经实验验证。该共培养构型兼容 B. bifidum 的存活和恢复（图 5d），但这些观察结果未提供空间氧气测量。需要空间分辨的氧气成像来绘制纤维和上皮区室间的氧气分布。在此构型下，上皮层本身暴露于低氧环境中，而非维持在全氧条件下；关键观察结果是，以 TEER 和 ZO-1 染色评估的屏障功能在测试的共培养期间得以维持（图 5a、b）。

甲基纤维素和 PGM 水凝胶纤维控制细菌相对于上皮层的空间定位。当纤维关联的细菌与单层细胞通过甲基纤维素隔开时，TEER 保持率最高；当细菌以悬浮形式添加时，TEER 保持率最低（图 5a）。将 B. bifidum 保留在纤维上，并配合中间的甲基纤维素层，与比悬浮构型更高的 TEER 保持率相关；但这组比较本身并未确立机制。在该条件下，ZO-1 染色显示出连续的紧密连接网络（图 5b）。

细菌存活率同样得以维持。SEM 显示共培养后恢复的细菌与纤维相关联（图 5c；图 S5），且将纤维转移至新鲜 MRS 培养基后 OD660 增加（图 5d）。因此，在测试条件下，组合构型同时兼容上皮屏障维持和 B. bifidum 存活。

### 4.4 意义与展望

本研究建立了一个常规 Transwell 共培养平台，整合了三维糖苷呈现的黏蛋白基质与油介导的氧气供应限制。与肠-芯片系统 [13] 相比，该平台无需专门的微流控或气氛控制设备。与简单的琼脂基共培养系统 [14] 不同，它提供了支持细菌定殖和生长的黏蛋白来源基质。本研究确立了共培养兼容性，但未直接证明下游宿主-微生物信号传导。因此，该平台可为未来宿主-微生物相互作用研究提供基础。

本研究的结果也界定了局限性和进一步发展方向。对糖苷降解产物、短链脂肪酸和菌落形成单位（CFU）的直接分析将有助于阐明细菌的利用情况和代谢活性。空间氧气分布图将解决系统内的氧气分布问题，而功能性上皮读出和多物种培养将推动该平台向宿主-微生物通讯研究扩展。力学性能、溶胀、降解稳定性、交联度和残留戊二醛未进行定量评估，关于这些性能未得出结论。平均纤维直径（~1 μm）超过了天然黏蛋白网的尺寸；因此，该材料更贴近松散黏液的孔隙组织，而非其纳米级结构。戊二醛交联可能会改变糖苷的可及性，而这种改变无法仅通过凝集素染色来评估。残留戊二醛和一般细胞相容性需要在未来研究中独立评估。

## 5. 结论

通过将糖苷呈现的黏蛋白基质与一种基于油的简单氧气供应限制方法相结合，我们在常规 Transwell 系统中建立了一个用于肠道宿主-微生物界面的体外共培养平台。PEO 作为临时纺丝助剂在戊二醛交联后被去除，从而获得主要由黏蛋白组成的三维多孔水凝胶纤维。该纤维保留了所检测的黏蛋白来源 O-糖苷表位，并支持 B. bifidum 的黏附、增殖、类似生物膜的生长以及向孔隙网络的浸润。在营养限制培养基中，细菌仅在纤维存在时生长；这一发现证明在纤维存在时发生生长，但并未证明对 O-糖苷的特异性利用。矿物油覆盖层与 Caco-2 细胞的耗氧作用共同使紧邻上皮层下方的传感器位置处的溶解氧降低。配合甲基纤维素和纤维介导的细菌定位，该方法实现了 Transwell 共培养，同时以 TEER 和 ZO-1 染色评估的上皮屏障功能得以维持，在测试条件下 B. bifidum 存活也得到保持。因此，这种以黏蛋白为主的水凝胶纤维为未来肠道宿主-微生物界面的研究提供了一个无需设备的平台。

### CRediT 作者贡献声明

Yuki Nakamura：撰写——初稿，可视化，方法论。
Momoka Hirosaki：撰写——初稿，可视化，方法论，调查研究。
Kanta Numata：可视化，方法论，调查研究。
Eiji Ishikawa：撰写——审阅与编辑，方法论。
Hiroki Miyajima：撰写——审阅与编辑。
Satoshi Fujita：撰写——审阅与编辑，可视化，监督，方法论，形式分析，概念构思。

### 生成式 AI 及 AI 辅助技术在写作过程中的声明

在准备本修订稿期间，作者使用了 ChatGPT/OpenAI Codex 协助语言修订和组织回应驱动性修改。作者审阅并编辑了所有输出内容，并对出版物的内容承担全部责任。

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