二价硒纳米疫苗同时靶向肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞，用于强效抗促结缔组织增生肿瘤免疫治疗

《Biomaterials》：Bivalent Se Nanovaccines Targeting both Tumor Cells and Cancer-associated Fibroblast for Potent Anti-desmoplastic Tumor Immunotherapy

　　

摘要

当前癌症疫苗主要聚焦于诱导癌细胞特异性免疫应答，但由于肿瘤微环境极其复杂，其疗效非常有限。在此，我们利用硒（Se）纳米佐剂简便地构建了靶向黑色素瘤和癌症相关成纤维细胞（CAF）的双价DNA纳米疫苗，该设计基于CAF在硬癌样肿瘤中的关键作用以及硒元素在免疫调控中的重要地位。令人振奋的是，双价硒纳米疫苗通过触发多种 Toll 样受体（如 TLR3、TLR9）信号通路，增强抗原交叉呈递并缓解 ROS 应激，显著诱导了强大的双特异性免疫应答，包括更多活化的巨噬细胞、具有增强多功能性的高比例 OVA+FAP+CD8+ T 淋巴细胞、更多生发中心 B 细胞和短寿命浆细胞，从而产生高滴度的双特异性抗体。更重要的是，双价纳米疫苗能够高效诱导强大的免疫记忆应答，如记忆 B 细胞、长寿命浆细胞、脾脏中的中央记忆及效应记忆 T 淋巴细胞以及皮肤中的组织驻留记忆 T 淋巴细胞。双价纳米疫苗作为预防和治疗的两种模式，通过特异性损伤 B16-OVA 肿瘤细胞和 CAF，并重塑肿瘤免疫微环境（如诱导更多抗肿瘤免疫细胞（如 NK、NKT、杀伤性 T 细胞）浸润，并减少髓源性抑制细胞和肿瘤相关巨噬细胞），显著抑制了黑色素瘤的进展。本研究为下一代靶向硬癌样肿瘤的疫苗提供了独特的硒纳米佐剂平台。

引言

随着对肿瘤生物学的深入了解，靶向治疗、个性化治疗和癌症免疫治疗等诊疗模式的发展在恶性肿瘤的诊断和治疗方面取得了显著进展。[1] [2] [3] 然而，由于肿瘤发生、进展机制复杂且具有异质性，恶性肿瘤仍然是严重威胁人类健康的主要疾病之一。[4] [5] 同时，治疗后的肿瘤复发仍然是癌症治疗面临的重大挑战之一。[6] 作为一种新兴的治疗模式，涉及免疫检查点阻断、免疫细胞输注和癌症疫苗的癌症免疫治疗在对抗癌症进展方面展现了巨大潜力，[7] [8] 但由于肿瘤异质性，其临床应答效果仍不尽如人意。实际上，免疫检查点阻断和免疫细胞输注的相对高昂费用显著限制了其临床应用。与检查点阻断和细胞输注治疗不同，癌症疫苗具有成本低、易于制造以及诱导特异性抗肿瘤免疫应答和免疫记忆的能力，在对抗肿瘤进展和复发方面引起了极大关注。[9] [10] 然而，由于其抑制活性有限，至今尚无癌症疫苗获得临床批准。如何合理设计能够高效对抗肿瘤复发的高功效癌症疫苗仍是亟待解决的重大需求。

实际上，除了肿瘤细胞外，肿瘤组织中还存在不同类型的基质细胞，如免疫细胞、内皮/上皮细胞，尤其是在硬癌样恶性肿瘤中。[11] [12] [13] [14] [15] 所有这些基质细胞在促进肿瘤发生和进展中发挥关键作用，这在 Paget 的"种子与土壤"理论中得到了明确的阐述。在肿瘤发生的早期阶段，肿瘤细胞通过分泌多种细胞因子（包括 TGF-β、IL-10 等）激活并诱导邻近的成纤维细胞、内皮细胞或上皮细胞分化为癌症相关成纤维细胞（CAF）。[16] 在黑色素瘤、乳腺癌和肺癌等硬癌样肿瘤中，超过 50% 的基质细胞为 CAF。同时，CAF 会分泌大量胶原蛋白以及多种细胞因子和趋化因子（包括 TGF-β、IL-10、SDF1 和 CXCL12），这些因子进一步与肿瘤细胞及其他基质细胞相互作用，通过增强肿瘤血管生成、提高肿瘤细胞的耐受性和侵袭性以及促进免疫抑制细胞（包括髓源性抑制细胞（MDSC）、调节性 T 淋巴细胞（Treg）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM））浸润至肿瘤部位，进一步促进肿瘤发生和进展。[13] [17] CAF 诱导的这些变化将显著抑制效应细胞（如自然杀伤细胞（NK）和杀伤性 T 淋巴细胞（CTL））的抗肿瘤活性。[18] [19] 换言之，肿瘤细胞与基质细胞（尤其是 CAF）之间的相互作用显著决定了肿瘤复发早期阶段肿瘤的发生，这可能是癌症疫苗开发的关键靶点。越来越多的研究[20] [21] 已证实，清除或抑制 CAF 在重振抗肿瘤免疫应答以抑制肿瘤生长和转移方面具有巨大潜力。例如，靶向 CAF 的 siRNA 递送系统通过选择性下调 CAF 中 CXCL12 趋化因子的表达，通过重塑肿瘤微环境，在对抗原位前列腺癌进展和转移方面表现出高效性。[22] 实际上，由于复杂的肿瘤微环境和这些治疗策略的局限性，难以在肿瘤复发的早期阶段及时高效地清除 CAF，这或许可以通过针对 CAF 的疫苗诱导的特异性免疫应答来克服。然而，目前报道的大多数癌症疫苗主要聚焦于损伤肿瘤细胞。因此，开发能够选择性破坏肿瘤细胞和基质细胞（尤其是 CAF）的双靶点癌症疫苗可能是对抗肿瘤复发的一种有前景的模式。

迄今为止，已开发了不同类型的纳米材料作为抗原和佐剂递送平台，以增强细胞对抗原的摄取并保护抗原免受降解，从而提高疫苗的免疫原性。[23] [24] [25] 实际上，随着肿瘤的进展，免疫细胞（尤其是位于肿瘤组织中的免疫细胞）逐渐表现出功能障碍或低反应性，这主要归因于肿瘤细胞和免疫抑制细胞分泌的抑制分子的负面影响以及恶劣的微环境（如酸性和缺氧环境）。[26] [27] 然而，目前报道的纳米材料主要作为递送系统，难以解决这一挑战，开发多功能平台需要不同的功能分子。因此，迫切需要以简便的方法开发多功能双价纳米疫苗，以缓解免疫细胞功能障碍并诱导强大的双特异性免疫应答，同时损伤肿瘤细胞和 CAF，以对抗硬癌样肿瘤。

通过仔细分析免疫细胞功能维持的关键参数，发现硒蛋白（如谷胱甘肽过氧化物酶（Gpx）和硫氧还蛋白还原酶（TrxR））在调控免疫代谢以满足激活需求方面发挥关键作用，其机制涉及调节氧化还原平衡。[28] [29] 例如，硒缺乏会导致免疫细胞功能障碍，而补充硒可以有效增强免疫细胞功能及其反应性，或通过重塑硒蛋白（尤其是 Gpx4）的表达来保护其免受氧化还原应激下的铁死亡。[28] [29] [30] [31] 同时，大量临床证据表明，硒缺乏与不同类型恶性肿瘤的发生和进展之间存在显著相关性。[32] 实际上，在我们先前的研究中，发现硒纳米佐剂可以作为通用模式，通过工程化硒物种（尤其是亚硒酸盐）与抗原之间的相互作用，高效递送多肽（SARS-CoV-2 的 RBD）、[33] 蛋白质（卵清蛋白，OVA）、[34] 灭活病毒[34] [35] 和细菌细胞外囊泡[36]，从而显著改善其免疫原性。

作为一种典型的抗原，DNA 抗原在诱导针对内源性入侵（包括恶性肿瘤）的细胞免疫方面具有独特优势。[37] 在此，受到 CAF 在肿瘤进展中的关键作用以及硒纳米佐剂在多肽/蛋白质/灭活病毒/细胞外囊泡和免疫调控中的普遍性的启发，我们通过工程化亚硒酸盐与编码 OVA 蛋白（pOVA，作为肿瘤模型抗原）和成纤维细胞激活蛋白（pFAP，作为 CAF 特异性抗原）的质粒 DNA 之间的相互作用，采用还原法简便地合成了硒纳米佐剂基双价 DNA 疫苗（定义为 SeNPs@pFAP/pOVA）（图 1）。测定结果显示，硒纳米佐剂通过 Se-O、Se-N 和 So-P 键与质粒 DNA 相互作用，同时质粒 DNA 既作为抗原又作为硒纳米佐剂的分散剂（同时也是 DNA 抗原的载体）。同时，硒纳米佐剂能够显著增强 pOVA 和 pFAP 抗原的表达，并通过激活多种 Toll 样受体（如 TLR3、TLR9）信号通路和缓解 ROS 应激，提高骨髓来源树突状细胞（BMDCs）交叉启动的功效并诱导 BMDCs 成熟。同时，与 SeNPs@pOVA 和 SeNPs@pFAP 相比，双价硒纳米疫苗高效激活了巨噬细胞，增强了辅助 T 淋巴细胞（Th，CD3+CD4+）和杀伤性 T 淋巴细胞（CD3+CD8+）在共分泌 TNF-α 和 IFN-γ 方面的多功能性，诱导了更高比例的双特异性 CD3+CD8+ T 淋巴细胞、滤泡辅助 T 淋巴细胞（Tfh）、生发中心 B 细胞（GCB）和短寿命浆细胞（SLPC），这些在诱导 Th1 偏向性细胞免疫和产生高滴度双特异性抗体中发挥关键作用。更重要的是，双价硒纳米疫苗在诱导强大的免疫记忆应答方面表现出更高的活性，如记忆 B 细胞、长寿命浆细胞（LLPC）、脾脏中的中央记忆（CD4+ TCM）和皮肤中的组织驻留 CD4+ T 淋巴细胞（CD4+ TRM）。值得注意的是，双价硒纳米疫苗高效诱导了皮肤中效应记忆（TEM）和组织驻留 CD8+ T 淋巴细胞（CD8+ TRM）的强大生成，这对于保护人体免受内源性入侵具有重要意义。此外，与 SeNPs@pOVA 和 SeNPs@pFAP 纳米疫苗相比，双价硒纳米疫苗作为预防和治疗模式，通过使用肿瘤复发模型，通过特异性损伤 OVA 表达肿瘤细胞和 CAF，增强抗肿瘤免疫细胞（如 NK、NKT、CTL 细胞）浸润，减少 MDSC 和 M2 表型肿瘤相关巨噬细胞（M2-TAM），显著抑制了 B16-OVA 黑色素瘤的进展。本研究开发了独特的硒纳米佐剂及其双价肿瘤疫苗，高效对抗硬癌样肿瘤，并为癌症疫苗及其联合治疗的设计提供了启示。

小节摘要

双价硒纳米疫苗以简便方法制备并表现出良好的稳定性

在我们先前的研究中，硒纳米佐剂可以通过类生物矿化相互作用，利用 Se-O、Se-N 和 Se-S 键在蛋白质和灭活病毒上原位合成。[34] [35] 因此，在本研究中，受质粒 DNA 结构和成分的启发，我们根据改良方案在质粒 DNA 抗原上简便地原位合成了硒纳米佐剂（图 1A）。简要而言，将质粒 DNA 抗原（pOVA 和/或 pFAP）溶液与亚硒酸钠（Na2SeO3）混合。

结论

近期，基于肿瘤新抗原的疫苗（包括纳米颗粒型疫苗）在对抗肿瘤进展方面展现了潜力，但仍需大量努力以提高其功效。实际上，肿瘤发生和进展的潜在机制非常复杂，涉及癌细胞与其他基质细胞之间极其精细的相互作用以及肿瘤微环境。然而，目前大多数癌症纳米疫苗主要聚焦于解决

双价硒纳米疫苗的合成

双价硒纳米疫苗采用改良方案，利用硒离子与 DNA 抗原之间的生物矿化相互作用合成，依据我们此前的研究。[34] [35] 简要而言，首先将 DNA 抗原（如质粒 OVA-pOVA 或质粒 FAP-pFAP）与 Na2SeO3 混合，搅拌 0.5 小时。然后，向混合物中滴加还原剂（Vc），并持续搅拌 2 小时。DNA 抗原、Na2SeO3 和还原剂的工作浓度分别为 200 μg/mL、5 mM 和 20 mM。

作者贡献声明

戴光侠：调查研究。朱安：方法论。徐立更：写作-审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取、数据管理、概念化。陈天锋：写作-审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。张云：调查研究、方法论、数据管理。邓云清：写作-初稿撰写、方法论、调查研究、数据管理。王英：软件、方法论、调查研究。

利益冲突声明

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究受国家自然科学基金（32371443-L.X.）、广州市重点技术研发计划（2025B03J0143-T.C.）和中国教育部基础与交叉学科突破计划（JYB2025XDXM802-T.C.）资助。

邓云清 | 全翠英 | 张云 | 王英 | 林晓敏 | 雷思明 | 朱安 | 戴光侠 | 陈天锋 | 徐立更

暨南大学化学与材料工程学院，生物活性分子及成药性评估省部共建国家重点实验室，教育部肿瘤分子生物学重点实验室，广州，510632，中国