FAP靶向金纳米簇介导的放射性配体治疗联合TGF-βRI抑制治疗肿瘤

《Biomaterials》：FAP-targeted gold nanocluster-mediated radioligand therapy in combination with TGF-βRI inhibition for tumor therapy

　　

摘要
靶向放射性配体疗法（TRT）是一种新兴的治疗模式，它选择性地将在肿瘤部位递送放射性同位素，同时保护健康组织。然而，优化 TRT 放射性药物以同时实现持续的肿瘤滞留和快速的全身清除仍然是一个基本挑战。具有有利药代动力学特性和可调血液循环半衰期的金纳米簇（GN）在解决这一问题方面具有优势。在这里，我们开发了一种可经肾脏清除的基于 GN 的 TRT 制剂（GNFAPI），该制剂能高效螯合诊断用 68Ga 或治疗用 177Lu 同位素，赋予其对成纤维细胞激活蛋白（FAP）富集且由癌相关成纤维细胞（CAF）主导的肿瘤基质进行精准靶向的能力，从而实现整合肿瘤诊疗一体化。PET 成像显示，在多种模型中，68Ga-GNFAPI 具有高肿瘤特异性摄取和肾脏清除能力，且在肝脏和脾脏中的滞留极少。在治疗方面，我们提出了基于放射挂钩的串扰切断（RHCC）策略，将 177Lu-GNFAPI 与 TGF-βRI 抑制剂协同作用。该策略利用 177Lu-GNFAPI 的β射线像强大的“挂钩”一样破坏基质和肿瘤细胞，同时抑制剂阻断肿瘤 - 基质串扰，从而消除 TGF-β-CAF-肿瘤反馈回路以抑制残余 CAF 的重新激活，抑制转移并增强抗肿瘤免疫。此外，患者来源的异种移植（PDX）模型中的物种特异性转录组学进一步阐明了潜在机制。在多种肿瘤模型中的验证，并在某些情况下实现了完全缓解，支持了其临床转化的前景。

引言
靶向放射性配体疗法（TRT）是肿瘤诊疗一体化中的关键模式，通过特异性配体 - 受体识别将放射性核素精准递送至恶性组织 [1,2]。这种创新方法具有“交叉火力”效应，能够消灭直接放射性配体靶向以外的癌细胞，同时最大程度地减少对照健康实质组织的附带损害 [3]。TRT 采用常规的靶向配体，包括单克隆抗体、小肽和小分子抑制剂，并已取得重大临床里程碑 [4]。值得注意的是，生长抑素受体 2（SSTR2）靶向和前列腺特异性膜抗原（PSMA）靶向放射性药物现在是神经内分泌肿瘤和前列腺癌的标准治疗部分，分别针对 [1]。然而，在临床转化中实现足够的肿瘤滞留和快速血液清除之间的最佳平衡仍然是一个未解决的挑战 [5,6]。为了解决这一问题，已探索了多种策略来优化体内行为，包括工程纳米抗体以实现深组织渗透，多聚化以延长循环时间，以及共价结合以增强肿瘤滞留 [[7], [8], [9]]。却而言，这些方法往往存在固有的权衡，凸显了需要一种新范式来从根本上解决“滞留 - 清除”困境的必要性 [1,2,10]。
超小金纳米簇（GN < 5 nm）表现出独特的生物和物理特性，作为放射性药物载体具有优势 [11]。它们的高比表面积支持大量的模块化配体偶联和放射性核素载荷。在肿瘤部位，其超小尺寸和刚性核心使它们能够有效地利用增强渗透和滞留（EPR）效应，促进深层肿瘤渗透和被动累积 [12,13]。至关重要的是，在细胞水平上，这种超小尺寸支持通过纳米簇介导的内吞等机制实现高效的细胞内化，而高原子序数（Z）的金核则作为强大的内在放射增敏剂 [14,15]。当与治疗性同位素（例如 177Lu）耦合时，发射的β粒子与金原子之间的相互作用会产生局部二次电子，有可能放大细胞内间隔的辐射剂量 [16,17]。在药代动力学方面，GN 表现出可调的血循环半衰期和肿瘤滞留能力，辅以有效的肾脏清除和最小的肝或脾累积 [18]。这种特性减少了脱靶毒性并增强了生物安全性。临床前研究表明，不同的放射性同位素（例如 64Cu、68Ga、177Lu 和 223Ra）已成功整合到 GN 中，并在模型中表现出明显的肿瘤累积 [[19], [20], [21], [22]]。此外，99?Tc-和 177Lu 标记的 GN 协同增强了放射治疗功效，同时诱导肿瘤免疫原性细胞死亡（ICD）[21]。这些优势使 GN 成为开发新型 TRT 制剂以满足日益增长的临床需求的有前途的平台。值得注意的是，我们早期尝试开发 pH 敏感 GN 以实现肿瘤酸触发累积的结果不太理想，这强调了在未来设计中将 GN 有优势的物理化学性质与针对肿瘤微环境（TME）的主动靶向机制相结合的重要性 [23]。
成纤维细胞激活蛋白（FAP）是一种丝氨酸蛋白酶，在多种肿瘤中激活的癌相关成纤维细胞（CAFs）上显著过表达，而在正常组织中表达极少，已成为放射性药物的主要靶点 [[24], [25], [26]]。最近的研究表明，CAFs 具有高度的异质性，主要由肌成纤维细胞性 CAFs（mCAFs）和炎性 CAFs（iCAFs）等不同的亚群组成 [27,28]。FAP 广泛表达于这些致病性 CAF 亚型中 [29]。因此，FAP 靶向 TRT 具有理论潜力，可以广泛耗竭占主导地位的 CAF 群体，而不是单个亚集 [30]。更重要的是，其在纤维增生性基质中的高表达赋予了其在结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌中的广泛适用性，避免了肿瘤细胞特异性靶向的有限患者资格。FAP 关键驱动 ECM 重塑、肿瘤免疫抑制、侵袭性、转移和不良生存结果 [31]。与容易因基因组不稳定性而下调或突变的肿瘤细胞表达的靶点不同，FAP 在遗传稳定的 CAF 群体中保持稳定的表达 [32]。当前的 FAP 靶向 TRT 制剂已在患有各种类型肿瘤的患者中显示出有前景的疾病控制 [32,33]。具体而言，小分子 FAP 抑制剂，特别是喹啉类单体如 FAPI-04 和 FAPI-46，在临床核成像中取得了成功 [[34], [35], [36], [37]]。然而，它们从肿瘤部位的快速洗脱导致辐射剂量递送不足，限制了其治疗最大化 [38]。为了克服这一局限性，研究人员开发了各种分子设计，包括 FAP 靶向肽（例如 FAP-2286）、同源二聚体（例如 DOTA-(FAPI)2）和白蛋白结合衍生物（例如 EB-FAPI），这些有效地延长了血液循环时间并增强了肿瘤累积 [[39], [40], [41]]。然而，如前所述，这些策略仍然受限于滞留 - 清除困境，因为延长的肿瘤滞留不可避免地增加了脱靶放射毒性。因此，开发 FAP 靶向的基于 GN 的放射性药物代表了一种战略必需的方法。值得注意的是，此类构建体在临床前研究中尚未被探索。
至关重要的是，肿瘤 - 基质串扰深刻地调节 FAP 靶向的治疗效果，令人信服的证据确定转化生长因子 -β（TGF-β）是双向肿瘤 - 基质信号的主要组织者 [31,42]。由肿瘤细胞和激活的 CAFs 分泌的 TGF-β驱动了一个自我强化的回路，激活致病性 CAF 表型，同时放大基质促肿瘤功能，包括 ECM 重塑、免疫抑制微环境形成和转移增强 [43,44]。值得注意的是，高 FAP CAFs 通过自分泌 TGF-β 维持其激活状态，同时增强肿瘤细胞侵袭性。反之，肿瘤衍生因子维持基质 TGF-β 信号，建立了一个破坏单药治疗、通常导致治疗失败的致病性前馈回路 [[45], [46], [47]]。从机制上讲，有效地关闭这一致病级联反应需要在受体水平进行精确阻断 [48]。在经典信号通路中，TGF-β 与 II 型受体（TGF-βRII）结合，随后募集并磷酸化 I 型受体 ALK5（TGF-βRI）[49]。至关重要的是，正是 ALK5 的特异性激酶活性直接磷酸化下游 Smad2/3，传递信号驱动负责 CAF 激活和肿瘤转移的基因转录 [43]。因此，靶向药物阻断 ALK5 激酶代表了解除肿瘤 - 基质串扰的关键策略 [45]。在临床上，破坏这种特异性轴已经显示出治疗效果。例如，在一项 II 期直肠癌试验（NCT02688712）中，加诺塞替（ALK5/TGF-βRI 抑制剂）联合放化疗达到了 32% 的完全缓解率，超过了历史基准 [50]。这种协同作用表明，中断这种串扰对于增强基质靶向的放射性配体疗法可能是至关重要的。
在此，我们报告了一种可经肾脏清除的 GN（GNFAPI），该制剂采用 GN 作为放射性药物载体，与大环螯合剂 1,4,7,10-四氮杂环十二烷 -1,4,7,10-四乙酸（DOTA）和 FAPI 偶联用于 TRT（图 1）。GNFAPI 进一步标记了发射正电子的放射性核素 68Ga（半衰期 68 分钟）或发射β射线的放射性核素 177Lu（半衰期 6.71 天）以精准靶向 CAF 主导的基质，从而创建了一个整合诊断和治疗纳米系统。为了有效解决由强健的肿瘤 - 基质串扰引起的疗效局限性，我们创新性地提出了基于放射挂钩的串扰切断（RHCC）策略，这是一种开创 177Lu-GNFAPI 放射性配体疗法与 TGF-βRI 抑制剂协同组合的新方法。我们假设 177Lu-GNFAPI 可以递送靶向电离辐射以物理破坏 CAF 主导的基质和肿瘤细胞，同时 TGF-βRI 抑制剂将同时瓦解促肿瘤的 TGF-β 信号回路，从而防止 CAF 重新激活并缓解免疫抑制。为了证明该策略的可行性，RHCC 策略的诊疗潜力、药代动力学特征和协同抗肿瘤疗效在多种临床前模型中进行了系统评估，包括 4T1、HT1080-FAP 和患者来源的异种移植模型（PDXs）。此外，采用物种特异性转录组分析来探索驱动肿瘤微环境重编程的潜在分子机制。

章节片段
GNFAPI 的合成、表征和标记
为了验证在肿瘤诊断和治疗中靶向 FAP 的合理性，我们首先系统分析了癌症基因组图谱（TCGA）数据库中的表达谱。如图 1a 所示，与邻近正常组织相比，FAP mRNA 表达在多种实体肿瘤中显著上调，突出了开发 FAP 靶向 TRT 制剂的潜力。GNFAPI 通过简便的单锅还原策略合理设计和合成，作为...

讨论
TRT 已成为一种有前景的精准肿瘤策略，但其临床转化受到一个核心悖论的阻碍，即在确保治疗效果的同时实现足够的肿瘤滞留，并通过快速清除将全身暴露降至最低。小分子放射性配体（例如 FAPI-04）由于配体 - 受体相互作用的可逆性而遭受短暂的肿瘤结合，而大分子制剂（例如单克隆抗体）往往累积在脱靶器官中，增加了毒性风险。以...

结论
总之，我们报告了一种可经肾脏清除的 TRT 制剂，68Ga/177Lu 标记的 GNFAPI 用于肿瘤诊疗一体化，并提出了 RHCC 策略以协同 177Lu-GNFAPI 介导的放射治疗基质破坏与 TGF-βRI 抑制，从而打破肿瘤 - 基质屏障，重塑肿瘤微环境，并增强抗肿瘤疗效。目前，68Ga-GNFAPI 的伦理审批申请已在上海交通大学医学院附属瑞金医院启动，聚焦于...

材料和试剂
三水合四氯金酸购自毕得医药（中国上海）。1,4,7,10-四氮杂环十二烷 -1,4,7,10-四乙酸（DOTA）购自鑫源伯美生物（中国陕西）。3 kDa 超滤管购自 PALL（MAP003C38）。谷胱甘肽（GSH）由生工生物提供（中国上海）。L-半胱氨酸 -FAPI（FAPI）由纳福生物合成并提供（中国上海）。DOTA-FAPI-04（FAPI-04）由上海阿肽生物提供（上海，C...

CRediT 作者贡献声明
杨慧珍：写作 – 审阅与编辑，写作 – 原始草稿，验证，方法论，形式化分析，数据整理，概念化。刘流：验证，方法论，资金获取。贾国平：验证，方法论，调查。高禾：写作 – 审阅与编辑，验证，调查。海王喜：验证，调查。吴清和：写作 – 审阅与编辑，调查。徐佳：方法论，调查。蒋怡飞：写作 – 审阅与编辑，监督，...

伦理声明
所有动物方案和程序均经上海交通大学动物伦理委员会批准（伦理批准号 2023002）。此外，肺癌细胞癌患者样本是在获得患者书面知情同意后获得的。临床样本的使用是根据上海交通大学附属胸科医院伦理委员会批准的方案进行的（伦理批准号 KS24021）。在动物研究中，随访的截止值...

利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82371997, 82272044）、中央高校基本科研业务费（YG2025ZD12）、上海市自然科学基金（23ZR1434800）、国家重点研发计划（2020YFA0909000）和中国博士后科学基金（GZC20231643）的支持。

作者及单位
杨慧珍 | 刘流 | 贾国平 | 高禾 | 海王喜 | 吴清和 | 徐佳 | 蒋怡飞 | 张春富
上海交通大学医学院附属第六人民医院骨科，上海交通大学生物医学工程学院，中国上海，200030