《Biomaterials》：Reengineering 3D cellular-scale stiffness gradient at the enthesis with biomimetic hydrogels to promote
in situ chondrogenesis
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摘要腱止点将肌腱/韧带与骨骼相连，形成一个具有独特细胞尺度组成和生物力学梯度的软-硬界面。腱止点损伤常见且随年龄增长而增加，然而，由于缺乏能够忠实模拟其细胞尺度梯度力学环境的生物材料，阻碍了对其脆弱性力学生物学基础的理解。我们显示，腱止点的细胞尺度刚度梯度随老化逐渐趋于平缓。
摘要
腱止点将肌腱/韧带与骨骼相连，形成一个具有独特细胞尺度组成和生物力学梯度的软-硬界面。腱止点损伤常见且随年龄增长而增加，然而，由于缺乏能够忠实模拟其细胞尺度梯度力学环境的生物材料，阻碍了对其脆弱性力学生物学基础的理解。我们显示，腱止点的细胞尺度刚度梯度随老化逐渐趋于平缓。这种与年龄相关的力学重塑减弱了软骨生成，并可能导致附着部位易于退化。为研究这一问题，我们开发了一种简单、可调且细胞相容的三维水凝胶，能够在生理相关范围内（2-119 kPa）产生尖锐的刚度梯度（约1 kPa μm?1），并局限于细胞尺度。利用该平台，我们发现细胞尺度刚度梯度能够引导腱止点 resident 干细胞进行软骨生成。在机制上，黏附感受器整合素β1/FAK和机械敏感性钙通道TRPV4汇聚于PI3K/AKT通路，以激活SOX9驱动的软骨生成。FAK促进TRPV4通道开放，而TRPV4介导的钙内流则放大FAK信号。此外，在一项老年大鼠腱止点损伤模型中，通过负载细胞的水凝胶恢复年轻态的刚度梯度，增强了软骨生成反应，并改善了组织学、基于影像学和功能性的愈合结果。这些发现将年龄相关的细胞尺度刚度梯度确定为调控细胞分化的一项重要力学特征，并突出了腱止点再生的潜在策略。
引言
运动功能依赖于多种组织类型的协调作用以及将它们耦合起来的专门界面。一个关键界面是腱止点，即肌腱/韧带插入骨骼的分级连接处[1]。在肌肉骨骼运动过程中，腱止点在将柔顺、纤维状肌腱/韧带的机械力传递至刚性、致密矿化骨骼中起着至关重要的作用[2]。肌腱与骨骼之间在组成、结构和机械性能方面的固有不匹配导致其连接处应力集中，从而削弱界面强度和韧性[3]。为抵消这一问题，腱止点具有独特的过渡结构，整合了细胞外基质（ECM）组成和细胞表型的梯度，形成了从肌腱，经过未矿化和矿化纤维软骨，到骨骼的连续过渡[2]。这种组织能够实现多尺度增韧机制，使连接处既保持柔顺又具有韧性，从而增强承重能力并降低失效率[3,4]。
尽管存在这些优化，腱止点仍然是频繁失效的部位，尤其是在老年人群中。肩袖撕裂是最常见的腱止点失效类型之一，其发生率随年龄稳步增加，流行病学研究报告显示，60多岁人群中患病率接近30%，80多岁人群中达到50%[5,6]。腱止点随年龄增长的ECM和细胞退化已有充分记录[7,8]。这些变化改变了组织组成、结构组织和局部力学环境，共同使腱止点易于受伤。然而，力学微环境随年龄相关的变化与肩袖退化之间的关系仍有待进一步探讨。
大量研究表明，ECM生物物理线索（例如，刚度[9]和粘弹性[10]）能够通过机械转导通路影响细胞命运。大多数先前的研究探讨的是均匀线索，而腱止点在组成和结构上具有急剧的过渡，在细胞尺度（数十到数百微米）上产生生物物理性质的空间梯度，尤其是刚度，这一长度尺度与单个细胞及其局部机械感受域的尺寸相当[11,12]。由于缺乏能够重现细胞尺度刚度梯度的真正生物模拟平台，这种腱止点特异性力学景观如何影响 resident 间充质干细胞（MSCs）仍然知之甚少。此外，大多数现有知识源于二维（2D）培养，这种培养方式导致细胞过度铺展，并与体内受限的三维（3D）微环境存在根本差异。历史上，从2D系统得出的结论不一定能推广到3D环境中[13]。因此，需要重建具有受控刚度梯度的3D腱止点模拟基质，以探索细胞如何解码这些生物物理线索。
在本研究中，我们量化了年轻和老年大鼠肩袖腱止点的力学和组成特征，并评估了 resident 细胞的分化潜力（图1a–c）。在这些数据的指导下，我们开发了一种三维、易于制备、负载细胞的具有受控刚度梯度的水凝胶，其匹配的原始刚度幅值和细胞尺度梯度范围（图1d）。利用这一生物模拟平台，我们研究了细胞尺度刚度梯度依赖性细胞分化中涉及的机械转导通路（图1e）。随后，我们将具有生物模拟刚度梯度的负载细胞水凝胶植入老年大鼠肩袖损伤模型中，以评估其对组织学、基于影像学和功能改善的影响（图1f）。总体而言，本研究探讨了由原生组织衍生的腱止点微环境力学特征如何调控细胞分化，并探索了其在腱止点再生策略中的潜在应用。
章节摘要
年轻与老年腱止点：生物力学、组成与细胞表型
肩袖撕裂在老年人中的高发率凸显了进行比较分析以阐明潜在机制的必要性。先前的研究提供的解释大多是描述性的（例如，细胞和ECM退化[7,8]，肩峰下撞击[14]，累积过度使用[15]）。这些框架很少考虑老化如何重塑腱止点的生物力学景观，或如何改变细胞机械感受和机械转导。为了解决这一问题，我们首先
结论
总之，我们确定了肩袖腱止点随年龄相关的力学和组成变化，并伴随软骨生成潜力降低。在这些见解的指导下，我们开发了一种三维、负载细胞的具有生物模拟细胞尺度刚度梯度的胶原平台。在该平台中，腱止点 resident 干细胞MSCs在年轻态细胞尺度刚度梯度上表现出增强的软骨生成。在机制上，整合素-β1/FAK和TRPV4介导的Ca2+内流汇聚于PI3K/AKT–SOX9
实验部分/方法
用于表征和肩袖损伤模型的动物与实验组：本研究的动物使用和程序已获得西安交通大学医学中心生物医学伦理委员会批准（批准编号：3097）。用于原生腱止点表征，从智山健康医学研究所（中国北京）获得十二只不同年龄的雄性SD大鼠，在标准实验室条件下饲养，可自由获取食物和水。六只雄性SD
CRediT作者贡献声明
吴玉宽：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念化。柏朗：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，调查，资金获取，概念化。田金：撰写——审阅与编辑，方法学，形式分析，数据整理。刘桥南：方法学，调查。艾艺翔：方法学，调查。李向阳：方法学，调查。徐锋：
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的财务利益冲突或个人关系，这些可能对本论文所报告的工作产生影响的。
致谢
我们感谢国家重点制造系统工程技术实验室的曲晓丽在共聚焦显微镜成像方面提供的帮助。本研究得到国家自然科学基金（82072429, 12225208, 12432015, 12272278）、中国中央高校基本科研业务费（xtr062024004）、陕西省重点研发计划（2024SF-YBXM-355, 2025SF-YBXM-450）以及陕西省管理
吴玉宽|柏朗|田金|刘桥南|艾艺翔|李向阳|徐锋|黄国友|尹占海
西安交通大学第一附属医院骨科，西安，710061，中国
