新型1-芳基-3-羟吡咯烷衍生物作为具有肺癌治疗潜力的HGK/HPK1双重抑制剂的设计、合成与生物学评价

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and biological evaluation of novel 1-aryl-3-hydroxypyrrolidine derivatives as dual HGK/HPK1 inhibitors with therapeutic potential for lung cancer

　　

摘要

近期研究表明，HGK作为MAPK/ERK信号通路的上游调节因子，是肺癌治疗的有前景靶点。本研究旨在探索新型HGK抑制剂，以高通量筛选获得的先导化合物Z1为基础，设计并合成了一系列1-芳基-3-羟基吡咯烷衍生物。通过全面的生物学评价，Z7被确定为最优化合物，具有强效的酶活性（HGK IC₅₀ = 0.047 μM）和细胞活性（H460 IC₅₀ = 1.42 μM）。值得注意的是，在选择性评估中，Z7对HPK1也表现出显著抑制作用（IC₅₀ = 0.065 μM），使其成为双重HGK/HPK1抑制剂。此外，Z7在80种激酶面板中表现出良好的选择性，并在H460异种移植模型中表现出显著的体内抗肺癌疗效（在20 mg/kg剂量下TGI = 68.94%）。总体而言，我们的研究表明，双重靶向HGK和HPK1是肺癌治疗的可行策略。

引言

MAP4K家族包含七个成员（MAP4K1-7），在丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联中充当上游调节因子，在调节多种细胞过程（包括增殖、存活、凋亡和迁移）中发挥关键作用[1]，[2]。其中，MAP4K1（造血祖细胞激酶1，HPK1）和MAP4K4（肝细胞祖细胞激酶样/生发中心激酶样激酶，HGK）具有结构同源性，信号功能部分重叠，在肺癌发病机制中发挥不同但互补的作用。

HPK1主要表达于造血细胞，作为T细胞受体（TCR）信号的负调节因子发挥作用[3]，[4]。当TCR被激活时，HPK1磷酸化适配蛋白SLP76的Ser376位点，使TCR信号复合物不稳定，从而损害T细胞活化和增殖[5]。在肺癌肿瘤微环境（TME）中，HPK1活性升高导致T细胞耗竭和对PD-1阻断的耐药性[6]。临床前证据表明，HPK1敲除或药理学抑制可增强细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应功能并改善抗肿瘤免疫[7]，[8]。

同时，HGK在人体组织中广泛表达，特别是在多种肿瘤类型（包括肺癌）中过表达[9]，[10]。HGK通过激活JNK和ERK信号通路，驱动肿瘤细胞的增殖、存活、上皮-间充质转化（EMT）和转移[11]，[12]。临床上，HGK高表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者的预后不良、晚期和转移相关[10]，[13]。HGK敲低在体外和体内均抑制肺腺癌细胞的增殖、锚定非依赖性生长和迁移[12]。

鉴于HPK1抑制抗肿瘤免疫而HGK促进肿瘤侵袭性和增殖，同时抑制这两种激酶为肺癌提供了一种合理的"双管齐下"治疗策略。一种双重HGK/HPK1抑制剂可以缓解T细胞抑制以增强免疫介导的肿瘤清除，同时直接损害肺癌细胞的恶性程度和转移能力。这种双重机制可能克服单药治疗的局限性，并在免疫检查点抑制剂（ICI）耐药或转移性肺癌中提供特殊益处。此外，HGK和HPK1的N端激酶结构域具有高度相似性[14]，[15]，包括保守替换在内相似度约为60%–65%（UniProt数据库），为双重抑制剂的设计提供了结构基础。遗憾的是，据我们所知，很少有化合物被报道能同时抑制HGK和HPK1。

目前，已有多种选择性HPK1抑制剂被报道[16]，[17]，其中若干候选药物已作为单药或联合PD-1/PD-L1检查点免疫治疗进入I期或II期临床试验，用于治疗多种肿瘤，例如BGB-15025[18]，[19]和NDI-101150[20]，[21]。值得注意的是，为了与铰链区形成氢键，大多数HPK1抑制剂被设计为含有氨基嘧啶核心或其生物电子等排体[22]，例如吡嗪甲酰胺衍生物AZ3246[23]和氮杂吲哚衍生物BAY-405[24]（图1）。类似地，选择性HGK抑制剂如GNE-495[25]、F389-0746[26]和PF6260933[27]也具有类似的药效团，能与HGK铰链残基Glu106和Cys108形成氢键，这些残基是参与配体相互作用的关键氨基酸。然而，尽管HGK抑制剂已在视网膜新生血管形成、II型糖尿病和胰腺癌模型中显示出体内疗效，但HGK抑制剂的研究仍然有限，迄今为止尚无候选药物进入临床试验。

本研究旨在探索强效HGK抑制剂，基于自有化合物库进行了高通量筛选，获得了具有新颖骨架的先导化合物Z1（在2 μM下抑制率为56.3%，HGK IC₅₀ = 1.82 μM）。利用骨架跃迁和结构简化策略，后续优化工作得到了Z7（HGK IC₅₀ = 0.047 μM），其具有良好的体内和体外抗肺癌疗效。值得注意的是，Z7在选择性评估中也对HPK1表现出强效抑制作用（IC₅₀ = 0.065 μM），使其成为有望双重靶向HGK和HPK1的先导化合物。

章节片段

构效关系（SAR）研究

为了提高Z1的效力（表1），我们的优化工作从分析其在HGK中的结合模式开始。基于HGK与ATP类似物腺苷5′-（β,γ-亚氨代）三磷酸（AMPPNP）的共晶结构（PDB ID: 4U40）进行了分子对接研究。如图2所示，先导化合物Z1以类似于AMPPNP的构象占据ATP结合口袋。然而，Z1中的1-（3-溴咪唑并[1,2-a]嘧啶-8-基）哌啶片段无法与...

结论

鉴于HGK和HPK1在肺癌中的促癌作用，靶向这些激酶的抑制剂将对肺癌治疗高度有益。然而，目前被报道的双重HGK/HPK1抑制剂化合物很少。此外，靶向HGK的药物开发仍然极具挑战性，迄今为止尚无候选药物进入临床试验。

在本研究中，从高通量筛选获得的前导化合物Z1出发，设计了一系列具有...特征的新型HGK抑制剂。

化学

通用方法。除另有说明外，所有化学品均购自商业供应商，未经进一步纯化直接使用。柱层析使用市售200–300目硅胶进行。核磁共振波谱使用Bruker ARX-600 NMR或ARX-400 NMR光谱仪记录。数据表示如下：化学位移，裂分（s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；m，多重峰；dd，双二重峰；ddd，双双二重峰）

CRediT作者贡献声明

刘舒宇：撰写原稿，验证，监督，方法论，调查，概念化。马嘉俊：方法论，形式分析，数据管理。李尤：方法论，形式分析，数据管理。杨俊一：方法论，形式分析，数据管理。张大君：可视化，软件。蔡楠：撰写审阅与编辑，监督。谭泽辉：撰写审阅与编辑，监督。翟鑫：撰写审阅与编辑，监督，资源，项目

动物实验

本研究遵循ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南进行。

本研究获得了沈阳药科大学动物实验伦理委员会的批准。

未引用参考文献

[28]，[29]

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本论文工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（项目编号82173685和82574263）、辽宁省博士科研启动资金计划（项目编号2025-BS-0744）和中国博士后科学基金（项目编号2024M762164）的支持。

刘舒宇|马嘉俊|李尤|杨俊一|张大君|蔡楠|谭泽辉|翟鑫

沈阳药科大学基于结构的药物设计与发现教育部重点实验室，沈阳 110016，中国