多取代内酯的合成及福氏耐格里虫中的凋亡标志：探索其作为抗阿米巴原虫剂的应用潜力

《Bioorganic Chemistry》：Synthesis of polysubstituted lactones and apoptotic hallmarks in Naegleria fowleri: Exploring their potential as amoebicidal agents

　　

**摘要**

福氏耐格里虫是原发性阿米巴脑膜脑炎（PAM）的病原体，该病是一种中枢神经系统暴发性感染，大多数病例会导致死亡。目前尚无标准化治疗方案，现有疗法因疗效不稳定且毒性显著而受到限制。此前被报道具有杀锥虫和抗利什曼虫活性的β-羟基-γ-内酯类化合物具有共同的结构特征，即活性内酯羰基和立体定向羟基，这些特征通常与破坏原生动物寄生虫的氧化还原和线粒体稳态相关。基于此先例，我们假设同一骨架同样可能对福氏耐格里虫具有活性。我们评估了14种化合物在体外对福氏耐格里虫两个菌株（ATCC? 30808?和ATCC? 30215?）滋养体和包囊阶段的活性，其中包括10种此前报道的β-羟基-γ-内酯和4种通过β-消除反应获得的新合成α,β-不饱和-γ-内酯（丁烯内酯，SAM-13至SAM-16），并同步在鼠源巨噬细胞（J774A.1）和人类SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞中进行细胞毒性试验。SAM-1和SAM-5表现最为活跃，对滋养体和包囊均具有低微摩尔级IC??值；然而，两者的选择性差异显著，SAM-5显示出明显更宽的安全窗（选择性指数高达12.9），而SAM-1在选择性指数仅为1.2（神经母细胞瘤细胞），凸显了选择性作为进一步优化关键参数的重要性。相比之下，四种新合成丁烯内酯中有三种基本无活性（IC?? > 160 μM）；第四种SAM-14（由SAM-5衍生）保留了可测量但选择性较差的活性（IC?? = 56.9 μM，SI = 1.35），表明对游离β-羟基的依赖性与取代基相关，并为该骨架提供了初步的构效关系。机制研究显示，SAM-1和SAM-5在福氏耐格里虫滋养体中诱导了程序性细胞死亡的特征标志，包括磷脂酰丝氨酸外翻、染色质凝缩、线粒体去极化、ROS过量产生和F-肌动蛋白紊乱，同时伴随自噬空泡形成的互补证据。计算机ADME预测分析显示SAM-1和SAM-5具有有利的类药性，包括符合Lipinski五规则、高胃肠道吸收率以及可穿透血脑屏障，且两种化合物均不预测为P-糖蛋白底物。综上所述，这些发现将β-羟基-γ-内酯确定为抗耐格里虫药物发现中极具前景的、可穿透中枢神经系统的骨架，并勾勒了应指导其未来优化的结构决定因素。

**引言**

福氏耐格里虫是一种自由生活的阿米巴原虫，通常栖息于温暖的淡水或咸水环境中，其中高温（30–42 °C）、藻华和高浊度为其繁殖创造了有利条件。此类栖息地在热带和亚热带地区最为常见；然而，由于全球气温上升和气候模式变化，在温带地区温暖季节也有病例报告[1]、[2]。

该物种根据环境条件呈现三种不同的形态[3]。在有利条件下，滋养体阶段占主导地位，使有机体能摄食、繁殖并感染宿主。面对环境压力，如极端盐度或营养缺乏，福氏耐格里虫会转变为包囊阶段，其特征是形成保护性壁结构，代谢活性显著降低。福氏耐格里虫还能短暂采用具鞭毛形态，使其在水环境中能够游动以寻找更适宜的条件。

当人类接触这些栖息地时，福氏耐格里虫可作为原发性阿米巴脑膜脑炎的病原体，这是一种罕见但毁灭性的神经感染，常被称为"食脑阿米巴"感染[4]。这种暴发性且进展迅速的疾病主要影响儿童和青壮年，死亡率超过97%[5]。

暴露通常通过鼻腔发生，常发生在进行游泳或潜水等娱乐活动时[6]。进入后，滋养体沿嗅神经迁移，穿越筛板，侵入中枢神经系统（CNS）[7]。在此迁移过程中，福氏耐格里虫释放各种水解酶降解宿主组织，导致广泛坏死区域和脑实质的渐进性破坏[8]。除分泌可溶性酶外，福氏耐格里虫还释放细胞外囊泡（EVs），介导额外的非接触性损伤，破坏上皮紧密连接、诱导坏死并引起溶血，从而促进组织侵入[9]。

尽管侵袭凶猛，宿主会引发快速的先天免疫反应。中性粒细胞、巨噬细胞和小胶质细胞浸润感染部位，释放IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎细胞因子[10]。然而，这一反应通常不足以控制阿米巴，强烈的神经炎症成分可能进一步导致组织损伤[11]。缺乏有效的适应性免疫，加上感染的快速进展，进一步限制了宿主控制阿米巴的能力。

PAM的早期临床表现通常难以与细菌性或病毒性脑膜炎区分，使及时诊断变得复杂。常见症状包括发热、头痛、恶心、呕吐、颈强直、畏光、意识模糊和癫痫发作[2]。感染进展迅速，在几天内导致昏迷和死亡[12]。由于其罕见性和与其他中枢神经系统感染的重叠，诊断往往延迟，在许多情况下仅通过尸检确认[13]。这也归因于该领域对自由生活阿米巴的认知和经验有限，因为诊断依赖脑脊液的显微镜检查、包囊化/鞭毛诱导试验，或最终依赖于PCR或下一代测序等分子工具[14]、[15]。

PAM的治疗仍是重大临床挑战，主要由于疾病进展迅速（常在症状出现后两周内死亡）、诊断延迟以及当前治疗干预疗效有限[12]。两性霉素B通过静脉和鞘内给药仍为治疗基石，尽管其成功率有限且毒性显著[16]、[17]。其他药物如米替福新、利福平、阿奇霉素和阿扎类已被纳入多药联合方案，但仅有少数有记录的存活病例支持其使用[18]、[19]。

报告的少数存活病例通常接受了早期诊断、积极的多药联合治疗以及医疗诱导性低温等支持性护理策略[20]。这些罕见病例凸显了早期干预的重要性以及在风险区域提高临床认知度的必要性。

鉴于预后不佳和缺乏有效疗法，迫切需要设计新型抗耐格里虫分子，特别是那些能够穿越血脑屏障并对滋养体快速起作用的分子。

在此背景下，近年来植物化学物和小型合成分子作为有前景的抗阿米巴候选物脱颖而出[21]、[22]、[23]、[24]。各种化学骨架，如内酯类，已在体外显示出杀阿米巴活性[25]、[26]。其中，β-羟基-γ-内酯因能够破坏关键细胞过程并诱导受调控的细胞死亡形式而因其抗寄生虫活性而日益受到关注[27]。因此，更广泛地研究这些化合物以及通过几步制备新的合成衍生物，如α,β-不饱和-γ-内酯（亦称丁烯内酯），是一个有趣的研究领域。在此背景下，本研究旨在评估14种内酯类化合物的抗耐格里虫潜力。进行了计算机ADME（吸收、分布、代谢和排泄）预测以评估化合物的药代动力学特征，并在分子水平阐明其作用机制，以支持其向临床前评估和未来治疗应用的过渡。因此，本工作的新颖性不仅在于合成了四种新的丁烯内酯衍生物，更重要的是，首次评估了该内酯化学类型对福氏耐格里虫的活性，阐明了活性化合物触发的类凋亡和类自噬细胞死亡通路的机制，进行了与靶向中枢神经系统治疗相关的计算机BBB通透性和类药性分析，并通过直接比较亲本β-羟基-γ-内酯与其β-消除丁烯内酯类似物获得了构效关系见解。

**化学品**

评估的10种β-羟基-γ-内酯由Calero-Docina等人（我们研究组的先前研究）合成（详见补充信息中的方案S1和表S1）[27]。沿用了先前工作中的命名法，其中SAM-1和SAM-2对应同一产物，SAM-3和SAM-4对应同一产物。这些产物最初被设计为对映异构体，但实际获得的是外消旋混合物，如我们先前工作所述。

**SAM化合物的活性、细胞毒性和选择性指数**

14种分子最初针对福氏耐格里虫ATCC? 30,808?菌株进行了筛选。如表1所示，大多数受测分子显示出有限的抑制活性，而SAM-1和SAM-5脱颖而出成为最强效的候选物。这两种活性分子对该病原体的两个菌株均表现出高活性。同时，在鼠源巨噬细胞（J774A.1）和人类神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中评估了其细胞毒性，结果显示SAM-5（>605.9 μM）表现出……

**讨论**

近年来，全球范围内已报告了多例PAM病例。这种明显的增加不仅归因于诊断认知的提高，还归因于环境因素，如全球变暖正在改变福氏耐格里虫的生态分布并增加风险个体数量[2]。尽管存在这些流行病学变化，有效的治疗选择仍然极其有限。目前可用的药物，如两性霉素B和米替福新，存在显著的……

**作者贡献**

J.C.-P.、S.D.-H.、S.J.A.-M.、I.S.、J.L.-M.和J.E.P.设计了概念并组织撰写了手稿。S.D.-H.和S.J.A.-M.设计、合成并对化合物进行了化学分析。J.C.-P.进行了生物学评估。J.C.-P.、S.D.-H.、S.J.A.-M.、I.S.、J.E.P.和J.L.-M.参与了数据解释和验证。J.C.-P.、S.D.-H.和S.J.A.-M.撰写了手稿。所有作者均编辑了手稿并讨论了最终版本。

**CRediT作者贡献声明**

Javier Chao Pellicer：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原始稿、验证、方法论、调查研究、正式分析、数据管理、概念化。Samuel Delgado-Hernández：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原始稿、验证、方法论、调查研究、概念化。Sergio J. álvarez-Méndez：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 原始稿、验证、方法论、调查研究、概念化。Ines Sifaoui：撰写 – 审阅与编辑、验证、……

**资金来源**

本工作由西班牙马德里卡洛斯三世健康研究所的CIBERINFEC（CB21/13/00100）、西班牙卫生部、消费与社会福祉部资助，以及Tenerife岛议会授予的CC20230222、CABILDO.23基金资助。J. C.-P.的合同由Tenerife岛议会2023–2028年项目CC20230222、CABILDO.23资助。I.S.获得ULL-拉卡伊萨基金会-卡哈卡纳里亚斯基金会2024年博士后奖学金资助。S.D.-H.感谢来自……的支持。

**利益冲突声明**

作者声明不存在可能影响本论文所报告工作的已知竞争性财务利益或个人关系。

**致谢**

作者衷心感谢M.Sc. Dácil Carballo在初步合成工作中的协助、Prof. Víctor S. Martín通过富有价值的讨论、财务贡献和实验室设施准入所提供的支持，特别是感谢Assoc. Prof. Celina在合成工作和富有洞察力的想法方面的贡献：本工作献给她的纪念。

Javier Chao Pellicer|Samuel Delgado-Hernández|Sergio J. álvarez-Méndez|Ines Sifaoui|José E. Pi?ero|Jacob Lorenzo-Morales

Canarias热带疾病与公共卫生大学学院，La Laguna大学，Avenida Astrofísico Francisco Sánchez, s/n, 38203 La Laguna, Tenerife, Spain