《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Preparation of oxygen-filled adipose-derived stem cells exosome-nanobubbles gel for ultrasound-assisted full-thickness wound healing in rats
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有效伤口愈合常因缺氧、炎症和血管生成受损而受阻。尽管基于间充质干细胞（MSC）的治疗显示出潜力，但其临床应用仍受限。因此，MSC来源的外泌体，尤其是脂肪干细胞外泌体（ADSC-Exos），已被提议作为无细胞替代方案；然而，它们仍面临包括靶向递送效率欠佳在内的局
有效伤口愈合常因缺氧、炎症和血管生成受损而受阻。尽管基于间充质干细胞（MSC）的治疗显示出潜力，但其临床应用仍受限。因此，MSC来源的外泌体，尤其是脂肪干细胞外泌体（ADSC-Exos），已被提议作为无细胞替代方案；然而，它们仍面临包括靶向递送效率欠佳在内的局限性。为解决现有再生疗法中的这些关键障碍，研究人员从脂肪组织中分离出ADSC-Exos，并制备了一种新型超声响应性卡波姆基水凝胶，其负载富氧ADSC-Exo纳米泡（Gel–Exo–NB+US）。利用Wistar大鼠全层伤口模型评估了所开发纳米水凝胶的临床前伤口愈合潜力。所设计的水凝胶表现出良好的理化性质，包括剪切变稀和触变行为，可实现高效局部给药并增强组织粘附。在大鼠全层皮肤缺损模型中，Gel–Exo–NB与Gel–Exo–NB+US联合治疗在所有组中实现了最高的伤口闭合率，同时伴有再上皮化增强、瘢痕指数降低、CD31和α-SMA表达升高、成纤维细胞增殖增加以及血管形成增多。此外，与Gel–Exo–NB治疗组相比，Gel–Exo–NB+US治疗组观察到前所未有的毛囊再生和丰富的胶原沉积，凸显了超声在皮肤缺损再生中的关键作用。值得注意的是，所产生的胶原沉积、丰富毛囊和薄表皮表明该治疗具有无瘢痕愈合的潜力。这些治疗结局归因于超声介导的外泌体治疗与氧输送的协同效应。
论文解读：载氧脂肪干细胞外泌体-纳米泡水凝胶联合超声促进大鼠全层皮肤伤口愈合的研究
一、研究背景与问题
皮肤作为人体最大的器官，其完整性对维持机体内环境稳定至关重要。创伤、手术等造成的皮肤缺损常常因伤口面积过大、感染、患者年龄及糖尿病等基础疾病因素而愈合延迟，严重损害患者生活质量并加重医疗负担。传统的临床治疗策略，如自体皮肤移植、负压吸引和各种伤口敷料，虽能提供一定程度的创面覆盖，但往往无法在恢复皮肤原生功能的同时实现美观的无瘢痕愈合。
近年来，间充质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）疗法因其再生潜力而备受关注，但存在免疫排斥、植入效率低、致瘤风险及伦理争议等问题。因此，MSC来源的外泌体，特别是脂肪干细胞外泌体（adipose-derived stem cell exosomes, ADSC-Exos），凭借其天然的低免疫原性、良好生物相容性及促进血管生成、调节细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑等再生功能，被视为极具前景的无细胞治疗替代方案。然而，外泌体疗法仍面临靶向递送效率欠佳、体内清除快等瓶颈。此外，创伤局部微环境常处于缺氧状态，这严重阻碍了外泌体的内化及细胞信号传导，进而抑制伤口愈合过程。基于上述问题，本研究旨在构建一种集外泌体治疗、局部供氧和超声（ultrasound, US）物理调控于一体的多功能无细胞治疗平台，以期协同促进全层皮肤缺损的修复。
二、研究内容与结论
研究人员从Wistar大鼠脂肪组织中分离并鉴定ADSC-Exos，通过载氧处理将其转化为外泌体纳米泡（Exo-NB），并将其整合入卡波姆基水凝胶中，构建了超声响应性纳米水凝胶（Gel–Exo–NB）。随后在大鼠全层皮肤缺损模型中系统评价了该水凝胶单独或联合超声刺激（3 MHz, 1 W/cm2, 25%占空比, 7 min）的体内促愈合效果。
研究结果表明，Gel–Exo–NB与Gel–Exo–NB+US治疗均显著提高了伤口闭合率，促进了再上皮化，降低了瘢痕指数，并上调了CD31和α-SMA的表达。尤为重要的是，相较于单纯Gel–Exo–NB治疗组，Gel–Exo–NB+US组在胶原沉积、成纤维细胞增殖及毛囊再生方面表现出更为显著的优势，凸显了超声在皮肤再生中的关键作用。该联合治疗策略通过超声介导的外泌体递送与氧气释放的协同作用，实现了加速且高质量的伤口修复。
三、主要技术方法
本研究采用以下关键技术方法：（1）外泌体的提取与鉴定：采用差速离心结合超速离心法从Wistar大鼠腹股沟及腹部脂肪组织来源的ADSCs培养上清中分离外泌体，并通过动态光散射（DLS）、扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）及Western blot进行表征；（2）载氧外泌体纳米泡的制备：在真空密闭条件下将氧气充入外泌体悬液形成Exo-NB；（3）复合水凝胶的合成与表征：以卡波姆（Carbopol? ETD 2020 NF）为基础制备1 wt%水凝胶，将Exo-NB整合其中，并通过流变学、SEM、溶解氧（DO）检测等手段评估其理化性能；（4）体内动物实验：建立Wistar大鼠全层皮肤缺损模型（每只大鼠背部制造两个直径1 cm的圆形缺损，每种处理n=6），于术后第0、2、6、8、10天给药，并在第10、14天取材进行组织学与免疫荧光分析，其中样本队列来源为伊朗马什哈德医科大学药学研究中心动物实验室；（5）组织学与免疫染色分析：采用苏木精-伊红（H&E）染色、Masson三色染色评价组织形态学、胶原沉积和瘢痕指数；通过免疫荧光染色检测CD31和α-SMA表达情况。
四、研究结果
4.1 外泌体与纳米泡的提取与表征
通过DLS测定，提取的ADSC-Exos数量加权粒径为78.11 ± 4.80 nm，多分散指数（PDI）为0.38，Zeta电位为?19.06 ± 0.89 mV。SEM与TEM观察显示其为球形或杯状形态。Western blot结果证实外泌体标志物CD63、CD9、CD81及TSG101阳性表达，而内质网蛋白Calnexin阴性，表明外泌体分离成功。载氧后形成的Exo-NBs粒径增大至248.81 ± 12.61 nm，PDI为0.31，Zeta电位为?20.44 ± 0.36 mV，提示氧气成功封装。
4.2 水凝胶表征
SEM显示所制备的Gel和Gel–Exo–NB均呈现均匀多孔结构，载入Exo-NBs后表面略显粗糙，内部孔径轻微增大。流变学分析表明水凝胶具有剪切变稀特性（粘度随剪切速率增加而降低）及触变行为，有利于局部给药和组织粘附。溶解氧释放实验显示，Gel–Exo–NB+US组的氧释放平台期（约7.0 mg/L）显著高于Gel–Exo–NB组（约5.0 mg/L），而Gel-O2对照组氧浓度基本低于基线，证实超声刺激促进了氧的持续释放。
4.3 体内伤口愈合评估
在大鼠全层皮肤缺损模型中，Gel–Exo–NB+US治疗组于术后第6天即表现出显著加速的伤口闭合（38.68 ± 17.87%），优于Gel–Exo–NB组（24.32 ± 19.23%）和对照组（12.05 ± 7.15%）。至第14天，Gel–Exo–NB+US组伤口闭合率达81.88 ± 8.73%，而对照组仅为67.30 ± 3.37%。组织学分析显示，超声联合治疗组在第10天具有最高的真皮厚度和最佳的再上皮化效果，至第14天表皮层变薄，有利于降低瘢痕疙瘩形成风险。该组瘢痕指数显著低于其他组，且成纤维细胞增殖、毛囊密度和血管数量均显著增加。
4.4 胶原沉积与蛋白表达
Masson三色染色结果显示，Gel–Exo–NB+US组在伤后第10和14天均表现出最丰富且排列规则的胶原沉积，而其他组胶原纤维排列紊乱、纤维未成熟且增厚。免疫荧光染色分析表明，Gel–Exo–NB+US治疗显著上调了CD31（内皮细胞标志物）的表达，提示血管生成活性增强；同时，Gel-Exo-NB组的α-SMA（肌成纤维细胞标志物）表达亦有明显升高，表明其对创面收缩和修复具有积极作用。
五、总结与结论
本研究构建了一种创新性的卡波姆基水凝胶平台，将载氧脂肪干细胞外泌体纳米泡整合其中，并经超声刺激实现协同治疗。该策略在Wistar大鼠全层皮肤缺损模型中表现出优异的伤口愈合效果，具体体现为最高的伤口闭合率、增强的再上皮化、降低的瘢痕指数、促进的血管生成、成纤维细胞增殖及丰富的胶原沉积。尤为突出的是，超声联合治疗诱导了显著的毛囊再生，提示其在功能性皮肤再生乃至无瘢痕愈合方面的巨大潜力。这些治疗效应源于超声介导的外泌体靶向递送与局部氧供的协同生物学作用。尽管该研究尚存在仅在急性伤口模型中验证、未与临床商用敷料直接对比、缺乏部分对照组等局限性，但其所展示的无创、多因素协同治疗策略为临床伤口管理提供了新的思路，并具备良好的转化前景。
