《Biomedicine & Pharmacotherapy》：High-throughput primary B cell cytokines assay for drug screening in multiple sclerosis
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背景：抗CD20 B细胞耗竭疗法在多发性硬化（MS）中的显著成功，凸显了B细胞在驱动疾病复发缓解期炎症中的抗体非依赖作用。然而长期B细胞耗竭会导致感染增加，提示需要更具靶向性的治疗。目的：建立用于药物筛选的原发性B细胞高通量转化检测法。结果：研究人员呈递了从M
背景：抗CD20 B细胞耗竭疗法在多发性硬化（MS）中的显著成功，凸显了B细胞在驱动疾病复发缓解期炎症中的抗体非依赖作用。然而长期B细胞耗竭会导致感染增加，提示需要更具靶向性的治疗。目的：建立用于药物筛选的原发性B细胞高通量转化检测法。结果：研究人员呈递了从MS患者和健康个体分离的原发性B细胞检测法。研究人员测试了多种B细胞分离方法，比较了包括2信号和3信号激活模式、多种接种密度对促炎细胞因子白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）产生的影响，采用384孔微孔板与半自动化。伊布替尼（Ibrutinib）作为抑制包括布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）在内蛋白激酶、抑制B细胞增殖和存活的小分子，被用于验证微型化B细胞检测法以用于药物筛选。七种BTK抑制剂，即Ibrutinib与六种处于自身免疫病后期临床开发的新型化合物，以浓度-效应方式评估，作为检测法概念验证。结论：建立了384孔板格式的优化原发性B细胞检测法，并由Ibrutinib验证。此外，研究人员证实六种临床阶段BTK抑制剂显著影响B细胞活化及IL-6、TNF和GM-CSF分泌。
研究背景：多发性硬化（MS）中存在B细胞功能失调，抗CD20单抗可耗竭CD20+ B细胞并带来临床获益，但该类疗法无法充分清除中枢神经系统（CNS）内B细胞，且长期耗竭增加感染与免疫抑制风险。B细胞除产抗体外，还可作为抗原提呈细胞（APC）及促炎细胞因子来源，其中IL-6、TNF、GM-CSF与组织损伤和自身反应性维持有关。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）位于B细胞受体（BCR）与Toll样受体（TLR）信号交叉点，BTK抑制剂（BTKi）成为非耗竭型免疫调节策略热点，但缺乏人原发性B细胞上MS相关细胞因子输出的并列比较与可靠药物筛选模型。该研究即为此建立384孔微型化原发性B细胞检测平台。
论文发表于《Biomedicine》。
主要技术方法：研究人员使用瑞典卡罗林斯卡大学医院来源的健康供者buffy coat与新诊断未治疗MS患者的leukapheresis冻存样本，经Ficoll梯度获得外周血单个核细胞（PBMC），以磁珠阴性分选获取CD19+ B细胞；在384孔板中以2信号（如aIgM+CD40L、IL-2+R848）与3信号（aIgM/aIgGM+CD40L+IL-4/ODN2006/LPS）刺激，采用多重微球阵列定量IL-6、TNF、GM-CSF等，以CellTiterGlo评估活力，并以Ibrutinib及六种临床阶段BTKi进行浓度-效应验证。
研究结果：
3.1 测试不同原发性B细胞富集方法：研究人员比较CD19微珠阳性分选、Miltenyi阴性分选与EasySep阴性分选，发现阳性分选因微珠结合CD19（BCR复合物成分）致静息B细胞IL-6本底升高、刺激指数偏低，故后续采用Miltenyi B细胞分离试剂盒II阴性分选，纯度＞95%。
3.2 384孔微孔板格式支持高活力与强刺激：比较96孔与384孔及不同密度，384孔在25000细胞/孔时按每千细胞计IL-6刺激指数最高，证明微型化并降密度可行。
3.3 刺激条件优化：在384孔中滴定25000至1000细胞/孔及5种刺激方案，IL-6与TNF在各密度均可定量，GM-CSF仅在3信号可稳定检出；兼顾人B细胞异质性，选定4000细胞/孔用于MS患者B细胞测试。
3.4 在MS患者B细胞中验证刺激条件：用未治疗复发缓解型MS患者与健康者样本，发现aIgGM+aIgM合并CD40L+IL-4的3信号最适模拟致病B细胞，可诱导IL-6与GM-CSF显著改变，被选为药物筛选条件。
3.5 用Ibrutinib验证检测性能：以1 μM Ibrutinib作阳性对照，IL-6、TNF、GM-CSF的Z′因子分别为0.78、0.70、0.90；车辆对照跨六次实验CV为4.7±2.8%，IL-6效应量Cohen’s d为?0.89，显示检测稳健可筛。
3.6 七种BTK抑制剂剂量依赖抑制促炎细胞因子：六种临床BTKi加Ibrutinib在100 nM均抑制IL-6、TNF、GM-CSF＞50%且不损活力；浓度-效应中Remibrutinib（文中亦写作Remebrutinib）抑炎最强，Evobrutinib最弱，各药对IL-6与GM-CSF抑制优于TNF。
讨论总结：研究人员指出该微型化原发性B细胞检测可用少至约20 mL血所获细胞筛选数百化合物，缩小转化鸿沟；抗CD20疗效先于免疫球蛋白下降，支持B细胞抗体非依赖功能，GM-CSF+IL-6+TNF+ B细胞促致病T细胞反应，重建后调节表型恢复。小分子BTKi可透过血脑屏障（BBB）作用于CNS驻留记忆B细胞，优于抗体。Tolebrutinib、Fenebrutinib等临床进展支持BTK靶向价值；但该研究缺T-B共培养与CNS微环境，供者间变异存在，4000细胞/孔不能完全代表B细胞全复杂度，未来需单细胞RNA测序（scRNA-seq）与类器官补充。
结论部分翻译：研究人员建立并经由Ibrutinib验证了384孔微孔板格式的优化原发性B细胞检测法。此外，研究人员证实六种临床阶段BTK抑制剂显著影响B细胞活化及IL-6、TNF与GM-CSF的分泌。
