苯并咪唑并咔唑衍生物的设计、合成及其诱导PANoptosis的抗肝癌活性

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis and anti-hepatocarcinoma activity of benzimidazole-fused carbazole derivatives by inducing PANoptosis

　　

摘要

PANoptosis是凋亡、细胞焦亡和坏死后凋亡的组合，在肿瘤的发生和发展中起着关键作用。本文开发了一系列基于苯并咪唑-咔唑的化合物，这些化合物对八种不同癌细胞系表现出广泛的细胞毒性，并对HepG2细胞具有显著活性。其中，3m通过阻止HepG2细胞在G2/M期表现出最强的抗增殖作用。此外，3m能有效抑制细胞集落形成和迁移。在机制上，3m通过上调NLRP3、BAX/BCL2和cleaved caspase3的表达，同时气孔蛋白E（GSDME）切割为其N端片段（GSDME-N）以及增加MLKL的磷酸化水平，在HepG2细胞中诱导PANoptosis。此外，3m对pH/黏度具有响应性。本研究描述了一种用于癌症治疗的新型治疗药物3m，为理解这些化合物的抗癌特性提供了有价值的见解。

引言

原发性肝癌是全球第六大常见癌症，也是第三大癌症死亡原因，包括肝细胞癌（HCC）、胆管癌和混合性肝癌。其中，HCC是原发性肝癌的主要病理类型，约占原发性肝癌的85%-90%[1]。根据调查，估计2020年原发性肝癌有9060万例新发病例和83万例死亡，并且逐年增加[1]，[2]。HCC的发生是多种因素相互作用的结果。主要因素包括乙型肝炎或丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素、酒精中毒或非酒精性脂肪肝以及其他遗传因素[3]。目前，HCC最有效的治疗方法是手术切除或肝移植。然而，由于HCC易转移和复发的特点，近80%的患者无法从传统手术治疗中获益。多索非尼（索拉非尼）和仑伐替尼已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于治疗HCC。然而，据报道，索拉非尼和仑伐替尼仅能将HCC患者的中位生存期延长至1年[4]。因此，HCC已成为预后最差的恶性肿瘤之一，亟需开发创新的HCC治疗策略和新化学实体。

PANoptosis诱导剂可有效在体外和体内杀死癌细胞[5]，[6]，[7]，[8]，代表了HCC治疗的新方向[9]，[10]。Tang报道，IRF1（干扰素调节因子1）依赖性PANoptosis激活可以预防小鼠结直肠癌模型中由AOM/DSS（偶氮甲烷联合硫酸葡聚糖钠）诱导的结直肠癌发生，表明PANoptosis在癌症中起着广泛的作用[11]。此外，PANoptosis的发生已被证明可以增强传统癌症治疗方法的疗效，如化疗和放疗。半胱氨酸脱硫酶（NFS1）的敲低显著增加了结癌细胞对奥沙利铂的敏感性，因为NFS1缺乏和奥沙利铂治疗的协同效应通过增加细胞内氧化应激触发了PANoptosis [12]，[13]。此外，一些传统癌症治疗方法可以诱导PANoptosis。例如，生物富集和免疫浸润分析显示，PANoptosis和凋亡的接头蛋白FADD高表达的患者对化疗药物如5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）、硼替佐米、多西他赛和吉西他滨的响应优于免疫治疗[14]。

PANoptosis相关基因通过调节嗜酸性粒细胞水平影响肿瘤微环境中的肿瘤血管生成、炎症和免疫抑制，从而影响肿瘤的生长和扩散[15]。因此，能够监测肿瘤微环境并诱导PANoptosis的治疗诊断学是治疗肝细胞癌的前景候选药物。构建基于小分子的治疗诊断剂有两种主要的理性策略：连接和融合。在第一种策略中，通过合适的连接子将结合配体连接到信号分子以形成单一分子[16]，[17]。虽然有用，但修饰可以大大增加分子的大小，伴随着细胞膜通透性、口服生物利用度和药物特性等药理学性质的恶化，从而限制了其应用。在第二种策略中，探针和药物共享单一结构骨架，更容易构建具有更好药物特性的低分子量治疗诊断荧光探针。在本文中，我们报道了一系列具有pH和黏度双重响应的新型PANoptosis诱导小分子（图1）。

各章节摘要

化合物设计

苯并咪唑衍生物具有广泛的生物活性，作为靶向DNA和DNA相关过程的药物已被广泛研究。通过将荧光团咔唑融合到双苯并咪唑的支架中，我们合成了一系列苯并咪唑-咔唑化合物，3,6-双(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-9-甲基-9H-咔唑（7c，图1）[18]，该化合物对肿瘤细胞具有强烈的细胞毒性活性，并能诱导多种肿瘤细胞凋亡。这些化合物虽然具有

结论

在本研究中，设计并合成了一系列咔唑-苯并咪唑衍生物。抗肿瘤活性筛选表明，乙基取代系列优于苯基取代系列。3m对人肝细胞癌细胞HepG2和Bel-7402表现出强烈的抗肿瘤效果。在机制上，3m通过调节NLRP3、BAX/BCL2、Caspase 3、GSDME和MLKL等多种底物在HepG2细胞中诱导PANoptosis。然而，详细的机制

材料

除非另有说明，实验中使用的所有溶剂和试剂均购自阿拉丁试剂（上海，中国），未经进一步纯化即直接使用。反应通过TLC进行监测，斑点在紫外光（254 nm）下显色。目标化合物通过硅胶柱色谱分离纯化，以二氯甲烷/甲醇或石油醚/乙酸乙酯为体系进行梯度洗脱。NMR光谱：Bruker AVANCE NEO 600（Bruker

CRediT作者贡献声明

Wu Beibei（吴贝贝）：形式分析、数据整理。Xie Mingrong（谢明蓉）：方法学、形式分析、数据整理。Chi Bangguo（迟邦国）：方法学。Yang Lili（杨丽丽）：调查研究。Dai Changwei（戴昌伟）：调查研究。Wei Yongbiao（魏永彪）：原稿撰写、验证、监督、项目管理、资金获取、数据整理、概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的经济利益冲突或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到国家自然科学基金（编号：81760620）资助。

Wu Beibei（吴贝贝）|Xie Mingrong（谢明蓉）|Chi Bangguo（迟邦国）|Yang Lili（杨丽丽）|Dai Changwei（戴昌伟）|Wei Yongbiao（魏永彪）

广西医科大学药学院药物化学系，广西南宁市双拥路22号，530021，中国