基于大肠杆菌 Nissle 1917 的代谢工程实现肌肽的高效从头生物合成

《Bioresource Technology》：Metabolic engineering of Escherichia coli Nissle 1917 for efficient de novo biosynthesis of carnosine

　　

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  从B. thetaiotaomicron中鉴定了一种HisG，以增强E. coli中的组氨酸供应。
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  筛选了最佳启动子和RBS组合以激活基因表达。
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  在染色体中删除了7个基因并插入2个基因，以增强前体供应。
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  通过分子对接和饱和突变增强了Bacd的活性。
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  构建了一株以葡萄糖为原料生产14.39 g/L肌肽的E. coli菌株。

引言

肌肽是一种天然存在的二肽β-丙氨酰-l-组氨酸，最早于1900年在马骨骼肌提取物中发现（Gulewitsch & Amirad?ibi, 1900）。后续研究已证实其广泛存在于脊椎动物的肌肉和脑组织中（Boldyrev et al., 2013）。凭借其独特的理化性质，肌肽在多种生理过程中发挥着关键作用，包括抗氧化防御（Shao et al., 2004）、金属离子螯合、pH缓冲、抗糖化以及延缓细胞衰老（Fu et al., 2009, Mehendale et al., 1994, Reddy et al., 2005, Ryu et al., 2010）。值得注意的是，近年来的研究强调了其在COVID-19管理中的潜在治疗作用，表明其能够通过减轻细胞因子风暴来缓解组织损伤（Pachikian et al., 2021）。鉴于其广泛的生理活性，肌肽已被广泛应用于制药、营养保健品和化妆品行业，随着新应用的不断发现，其市场规模持续扩大（Liu et al., 2023a）。

目前，肌肽的工业生产主要依赖化学合成。尽管可行，但该方法受到肽键形成固有的复杂性的制约，需要多步保护和脱保护操作（Sheng et al., 2005）。这些操作不仅增加了生产成本，还产生了大量环境污染物，从而限制了可持续制造的可扩展性（Ding et al., 2021）。近年来，合成生物学为利用微生物细胞工厂生产肌肽开辟了新的途径。在酶转化领域，研究人员成功改造了二肽酶PepD以增强催化性能（Liu et al., 2023b），然而，该系统通常需要高摩尔比的β-丙氨酸来推动反应平衡，这与绿色和原子经济性制造的原则相矛盾。利用重组Cystobasidium minutum氨基肽酶DmpA，以54.54%的转化率合成了55.72 g/L肌肽，代表了迄今为止酶催化所达到的最高产率。关于从头发酵，近期的工作主要集中在通过表达异源肌肽合成酶和强化前体供应来改造Corynebacterium glutamicum ATCC 13032，实现了373 mg/L的滴度（Kim et al., 2021）。据我们所知，这仍然是目前报道的最高微生物发酵滴度之一。然而，该产率仍然远低于工业相关水平，相差几个数量级，主要原因是前体供应不足、异源酶的动力学性质差以及严格的胞内代谢调控等瓶颈。

为克服肌肽生物合成的多方面瓶颈，本研究采用了一种整合蛋白质工程、代谢重编程和辅因子再生的系统性策略。我们通过过表达限速酶ATP磷核糖转移酶HisG（来自Bacteroides thetaiotaomicron，BtHisG）、天冬氨酸α-脱羧酶PanD（来自Bacillus subtilis，BsPanD）和二肽连接酶BacD（来自Bacillus subtilis，BsBacD），这些酶均通过结构导向突变进行了改造，系统地缓解了途径限制（图1）。此外，还改造了中心代谢以最大化前体和ATP供应。最终菌株WYT17/pWT-Y3DG在5 L生物反应器中进行补料分批发酵后可生产14.39 g/L肌肽，这是迄今为止报道的最高微生物肌肽产量。这一显著提升表明我们工程菌株在未来工业应用中具有广阔的应用前景。

章节摘要

菌株、质粒和试剂

Escherichia coli Nissle 1917被用作代谢工程的起始菌株，DH5α被用作克隆宿主，Bacillus subtilis 168、C. glutamicum、Pseudomonas putida KT2440和Bacteroides thetaiotaomicron DSM 2079被用作基因克隆的实验室库存菌株。表达质粒载体为pTrc99a，基因组编辑使用CRISPR/Cas9编辑系统。

分析级肌肽、l-组氨酸和β-丙氨酸标准品购自Sigma-Aldrich（St. Louis，

在E. coli Nissle 1917中构建肌肽生物合成途径

为构建适合异源质粒稳定表达的微生物底盘，研究报道E. coli Nissle 1917中的内源质粒Pmut1和Pmut2可能与外源质粒的复制子不相容，导致后续发酵过程中丢失或拷贝数不稳定（Lin et al., 2024）。尽管之前的研究尚未阐明这两个质粒的具体功能，但有报道指出敲除它们不会

结论

本研究将表达系统优化、合理酶工程和系统性代谢工程相结合，以增强E. coli Nissle 1917中的肌肽产量。通过启动子和RBS优化，确定表达元件组合P_tac-R2具有最佳的转录和表达性能。通过筛选和鉴定一种新型高效酶BtHisG，显著缓解了l-组氨酸的前体供应瓶颈。该

CRediT作者贡献声明

Yaqun Tang：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化，调查研究。Guihong Zhao：调查研究，数据整理。Dezhi Zhang：调查研究，数据整理。Geer Liu：调查研究，数据整理。Zihan Li：调查研究，数据整理。Na Li：调查研究，数据整理。Xiaoyuan Wang：撰写——审阅与编辑，概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作由江苏省基础研究计划资助，并由江苏省合成生物学基础研究卓越中心支持（资助号BK20233003）。

Yaqun Tang|Guihong Zhao|Dezhi Zhang|Geer Liu|Zihan Li|Na Li|Xiaoyuan Wang