用于HeLa细胞和斑马鱼中半胱氨酸选择性检测的ESIPT-ICT协同近红外探针

《Bioorganic Chemistry》：An ESIPT-ICT synergistic near-infrared probe for selective detection of Cys in HeLa cells and zebrafish

　　

摘要

作为小分子硫醇，半胱氨酸（Cys）在生物体中发挥着至关重要的作用。它能够稳定细胞氧化还原状态，维持代谢平衡，并参与调节多种生理和病理过程。因此，构建用于Cys特异性检测的荧光探针具有重要意义。在本研究中，我们利用激发态分子内质子转移（ESIPT）和分子内电荷转移（ICT）的协同机制，成功合成了一种新型近红外荧光探针BIAC。该探针能够特异性识别和检测Cys。在532 nm激发下，其在710 nm处呈现最大发射峰，并具有178 nm的大斯托克斯位移。此外，探针与Cys的反应在40秒内即可完成。在0–100 μM范围内，荧光强度与Cys浓度之间呈现良好的线性相关性，检测限（LOD）为0.14 μM。此外，BIAC具有良好的低细胞毒性，已成功用于HeLa细胞和斑马鱼中Cys的检测，展现出其在生物成像应用中的潜力。

引言

半胱氨酸（Cys）是唯一天然含有侧链游离巯基的氨基酸。它在蛋白质折叠[1]、金属离子螯合[2]、[3]以及酶活性位的形成[4]中发挥作用，并有助于调节许多氧化还原依赖的细胞内信号通路[5]。作为谷胱甘肽（GSH）的前体，Cys能够有效清除活性氧（ROS），从而保护细胞免受氧化损伤[6]、[7]。此外，在细胞代谢中，Cys连接了硫代谢、能量代谢和氧化应激反应[8]、[9]。然而，Cys水平的失衡会导致一些疾病。Cys缺乏会损害抗氧化防御机制和肝脏解毒功能，导致脂肪肝和慢性肝损伤[10]，从而增加神经退行性病变和自身免疫性疾病的风险[11]。相反，Cys水平过高会增加心血管疾病和脑血管疾病的风险，如高血压、缺血性心脏病、心肌梗死、中风和脑出血[12]、[13]、[14]。因此，维持细胞内Cys浓度的动态平衡至关重要。

目前，已有多种分析方法可用于Cys的检测。然而，传统技术如高效液相色谱法（HPLC）、质谱法（MS）和电化学分析通常需要复杂的样品制备、昂贵的仪器和繁琐的操作步骤。这些局限性限制了它们在活体生物成像中的应用[15]、[16]、[17]。相比之下，荧光分析具有成本低、操作简便、灵敏度高和生物相容性好等优点，被广泛应用于化学生物和生物医学研究[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]。在这方面，已开发出多种用于检测Cys的荧光探针[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。然而，大多数探针的发射波长位于可见光范围内，容易受到生物样品背景荧光的干扰，而近红外（NIR）发射的荧光探针更有利于生物成像，因为它们能够实现深组织穿透并最大限度地减少自荧光[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。在构建NIR探针的各种光物理策略中，激发态分子内质子转移（ESIPT）机制引起了广泛关注。基于ESIPT的荧光团通常表现出大的斯托克斯位移和双发射特性[39]、[40]。然而，仅基于ESIPT的探针仍然存在一些固有局限性。它们的荧光发射通常发生在短波长范围内，且仅表现出单一响应模式[41]。为了克服这些局限性，研究人员将ESIPT与ICT相结合，开发出了多种双机制探针。这些探针结合了两种机制的优势，其扩展的π共轭结构使它们能够发射近红外荧光[42]、[43]、[44]、[45]、[46]。

受此双机制策略的启发，我们转向了传统的吲哚基荧光探针。尽管这些探针被广泛使用，但存在几个缺点，包括斯托克斯位移小、光稳定性差以及在复杂生物环境中信噪比低。这些局限性限制了它们在实时活体成像中的应用[47]、[48]。为了克服这些缺点，基于苯并吲哚鎓半花菁荧光核心，我们进行了合理设计，通过引入亚胺键作为共轭桥，并在萘环的酚羟基上引入丙烯酰基作为Cys响应位点，从而构建了ESIPT-ICT协同近红外探针BIAC。萘环的刚性双环结构增强了分子内电子离域，赋予了良好的光稳定性。更重要的是，当Cys触发丙烯酰基脱保护后，释放出的萘酚羟基与亚胺氮形成分子内氢键，为ESIPT过程提供了结构基础。在与Cys反应后，探针生成带有游离酚羟基的BI-OH，从而激活了ESIPT和ICT双信号通路。光谱测量证实BIAC在710 nm处呈现最大发射峰，斯托克斯位移为178 nm。大的斯托克斯位移减少了散射激发光和生物自荧光的背景干扰，提高了复杂生物样品中的信噪比。此外，该探针对Cys的响应迅速，在40秒内即可实现特异性识别，适用于生物系统中的实时动态监测。由于苯并吲哚鎓骨架固有的正电荷，BIAC表现出优异的细胞膜通透性，能够高效穿透生物组织，实现HeLa细胞和斑马鱼中外源性和内源性Cys的原位荧光可视化。

章节片段

BIAC的合成

详细的合成步骤见支持信息。

在N?气氛下，将化合物BI-OH（1 mmol，481.23 mg）和Et?N（3 mmol，303.36 mg）溶解于无水CH?Cl?（10 mL）中。反应在冰水浴中搅拌20分钟，然后在0°C下加入丙烯酰氯（3 mmol，0.24 mL）。随后反应在室温下进行12小时。去除溶剂后，所得粗产物通过柱色谱法进行纯化（方案1）。¹H NMR

光谱响应特性与灵敏度

为评估该探针的性能，我们首先测量了其紫外-可见吸收光谱。该探针在482 nm处呈现最大吸收峰。在与Cys反应后，该峰红移至532 nm，表明探针与Cys发生了反应（图1a）。接下来，我们进行了荧光光谱测量。在532 nm激发下，探针在710 nm处几乎没有荧光发射。然而，当加入Cys后，在同一波长处观察到明显的荧光增强

结论

在本工作中，我们开发了一种近红外荧光探针BIAC，该探针基于协同ESIPT-ICT开启机制实现对Cys的选择性检测。通过¹H NMR滴定、HRMS和DFT计算验证了探针与Cys之间的识别机制。光谱实验表明，该探针表现出优异的性能：在532 nm激发下，其在710 nm处发射荧光，且加入Cys后该波长处的荧光强度显著增强。此外，

CRediT作者贡献声明

王健民： 原稿撰写、软件、方法学、调查、形式分析、数据管理、概念构思。杨金辉： 审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、资金获取。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究由宁夏重点研究与开发项目（2021BEE03003）和国家宁夏科技领军人才（2022）资助。

王健民|杨金辉

宁夏大学化学化工学院/煤的高效利用与绿色化工国家重点实验室，中国