发现一类基于6-甲氧基嘧啶的高效低分子量可逆SARS-CoV-2主蛋白酶(Mpro)抑制剂，具有抗病毒活性

《Bioorganic Chemistry》：Discovery of a new class based on 6-methoxypyrimidine as efficient low weight reversible inhibitors of SARS-CoV-2 main protease (Mpro) with antiviral activity

　　

SARS-CoV-2的主蛋白酶（Mpro）是病毒周期中的一个重要酶，其抑制会影响病毒复制和感染传播。因此，它被报道为药物设计的优良靶点。在本研究中，研究人员发现了一种低分子量非肽类杂环抑制剂，可灭活Mpro。首先，研究人员针对Mpro筛选了一个聚焦的杂环化合物化学库，其中包含若干半胱氨酸蛋白酶抑制剂。一个基于6-甲氧基嘧啶骨架的化合物被鉴定为该酶的抑制剂，构效关系研究揭示了所有对Mpro抑制重要的基团。对先导化合物的优化得到了一种小分子（306 g/mol）竞争性抑制剂，可灭活Mpro活性，且对其他半胱氨酸蛋白酶如PLpro、人CatL和cruzain不具有多效性。PH521（4f）在细胞中表现出增强的抗SARS-CoV-2感染效力，比初始先导化合物效力高20倍。

基于6-甲氧基嘧啶的新型低分子量可逆SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂PH521的研究解读

COVID-19由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起，已造成全球数亿人感染和数百万死亡。尽管疫苗显著降低了重症风险，但病毒的高突变率导致变异株不断出现，突破性感染仍常见，尤其是老年人和有基础疾病者。因此，开发有效且可广泛获取的治疗药物是当前的重要任务。SARS-CoV-2的主蛋白酶（Mpro）在病毒多聚蛋白加工中发挥关键作用，抑制Mpro可阻断病毒复制，且该酶在宿主中没有高度同源蛋白，是理想的药物靶点。已有批准药物nirmatrelvir为共价Mpro抑制剂，但已有研究提示其可能产生耐药性。因此，寻找非共价、可逆、低分子量且具有良好选择性的新抑制剂具有重要价值。本研究正是基于这一需求，通过筛选和优化发现了以6-甲氧基嘧啶为母核的新型可逆抑制剂PH521。论文发表在《Bioorganic Chemistry》。

研究人员开展了系统性工作：首先，对包含24个杂环化合物的化学库进行筛选，发现2,4-二胺-6-甲氧基嘧啶衍生物4a对Mpro具有82%抑制活性，且对其它半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease, CP）如PLpro、人CatL和cruzain无明显作用。随后通过构效关系（SAR）研究合成了一系列类似物，确定了关键药效团，并优化出先导化合物PH521（化合物4f）。该化合物分子量为306 g/mol，对Mpro的半数抑制浓度（IC₅₀）为0.14 μM（60 min预孵育），且表现为时间依赖性增强。跳稀释实验证实PH521为可逆抑制剂，Lineweaver-Burk图表明其以竞争性方式抑制Mpro。选择性实验中，PH521对PLpro、人CatL和cruzain的IC₅₀均大于100 μM，显示出高选择性。在细胞水平，PH521在Vero E6细胞感染SARS-CoV-2模型中显著降低病毒RNA拷贝数，其半数有效浓度（EC₅₀）为1.53 μM，比先导化合物4a（EC₅₀=30.66 μM）强20倍，且细胞毒性极低（CC₅₀>80 μM），选择性指数（SI）>52。分子对接模拟显示PH521与Mpro活性位点的关键残基Gly143、His41和Cys145形成氢键及疏水相互作用，其结合模式与已知共晶配体一致，且验证了6-甲氧基对活性的重要性。

接下来按研究结果的小标题分别介绍：

**2.1 Chemical library screening**：通过荧光酶活性实验筛选24个杂环化合物，发现嘧啶衍生物4a在20 μM时抑制82.12%的Mpro活性，远强于其它化合物。4a对PLpro无抑制，对cruzain和人CatL也无效，表明其非多效性。该结果支持选择4a作为优化起点。

**2.2 Structure activity relationship (SAR) and hit optimization**：合成17个新的6-甲氧基嘧啶衍生物，发现C4位苄胺基团是活性必需，C2位可耐受苯胺、杂环等取代基。其中PH521（4f）活性最优，IC₅₀为0.14 μM（60 min预孵育）。时间依赖性实验表明抑制活性随预孵育时间增加而增强，但跳稀释实验证实PH521、4h和4i均为可逆抑制剂。Lineweaver-Burk图显示PH521不改变V_max而增大K_M^app，呈竞争性抑制模式。

**2.3 Anti-SARS-CoV-2 activity evaluation and cytotoxicity activity**：通过RT-qPCR检测病毒基因拷贝数，发现PH521在20 μM时显著降低感染细胞中的病毒RNA，EC₅₀为1.53 μM，优于其它类似物。MTT实验显示PH521在80 μM内无细胞毒性，SI>52。

**2.4 In silico studies**：分子对接（Gold程序）预测PH521结合于Mpro催化活性位点。N1原子与Gly143形成氢键，嘧啶环与Cys145疏水作用，C2苯胺占据S1口袋，C4苄基伸入S2口袋，6-甲氧基与Leu27和Cys145疏水接触。该结合模式与Mpro-喹唑啉酮D8共晶结构有良好重叠。

**2.5 Study of the importance of 6-OMe for Mpro inhibition**：通过合成6位修饰为烯丙氧基（6a）和炔丙氧基（6b）的衍生物，发现其活性显著降低，印证6-甲氧基是维持有效抑制的关键取代基。

**2.6 Chemistry**：研究人员采用Buchwald-Hartwig偶联策略，从2-氨基-4-氯-6-甲氧基嘧啶出发，先后与芳基溴和胺类反应，高效构建了目标化合物，并通过NMR和HRMS确认结构。

讨论部分指出，本研究发现了一类全新的非共价可逆Mpro抑制剂骨架，具有低分子量、高选择性和良好细胞渗透潜力。与共价抑制剂nirmatrelvir相比，PH521不依赖亲电弹头，避免潜在的毒性和耐药性问题。SAR数据为后续优化提供了明确方向。

结论部分：本工作评估了含有38个杂环化合物的化学库对SARS-CoV-2半胱氨酸蛋白酶Mpro和PLpro的作用。在不同母核中，6-甲氧基嘧啶衍生物被鉴定为非多效性Mpro抑制剂，其中4-苄胺取代基对活性至关重要。计算机模拟表明该基团具有合适大小以容纳于S2口袋。嘧啶环C4和C2位的适当取代使抑制剂活性达到纳摩尔至低微摩尔范围。经过先导优化，研究人员发现了PH521，其效力较先导化合物4a显著提高。跳稀释实验确认了可逆结合模式，Lineweaver-Burk图表明PH521的竞争性作用机制。最后，该优化的Mpro抑制剂在抗病毒实验中显示最强活性（EC₅₀=1.53 μM），支持该类可逆抑制剂作为抗SARS-CoV-2药物后续探索的潜力。