《Biosensors and Bioelectronics》：Co-profiling of exosomal proteins and microRNAs using single microbead confinement for breast cancer diagnosis
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摘要肿瘤来源的外泌体（TEXs）在癌症诊断生物标志物方面具有巨大潜力，但其内在异质性和极端稀缺性阻碍了敏感而准确的鉴定。在单分子水平上协同分析外泌体蛋白和微小RNA（miRNA）可显著提升癌症诊断和预后的精度。在此，我们提出了一种单微珠限制的双模式检测系统，可选择性捕获TEX
摘要
肿瘤来源的外泌体（TEXs）在癌症诊断生物标志物方面具有巨大潜力，但其内在异质性和极端稀缺性阻碍了敏感而准确的鉴定。在单分子水平上协同分析外泌体蛋白和微小RNA（miRNA）可显著提升癌症诊断和预后的精度。在此，我们提出了一种单微珠限制的双模式检测系统，可选择性捕获TEXs并同步定量蛋白和miRNA标志物。外泌体蛋白通过测量富集在单微珠平台上的荧光信号进行定量。经珠上裂解后，单个miRNA由两种肽核酸（PNA）识别，与金纳米颗粒（AuNPs）的强光散射信号形成严格的严格一对一对应关系，从而实现单分子计数分析。通过全面分析，四联标志物面板实现了98.33%的最高诊断准确率，优于任何单个标志物或其他组合。重要的是，这是首次展示了一种通用的PNA修饰策略，利用DNA介导物防止AuNPs自聚集。该平台也只需更换适配体和PNA来靶向相应标志物即可适配其他癌症，显示出推进基于外泌体的液体活检和加速下一代临床诊断工具开发的巨大潜力。
引言
外泌体是一类细胞分泌的细胞外囊泡，直径在50至200纳米之间，广泛存在于血液、尿液和唾液等各种体液（Kalluri和LeBleu，2020；Doyle和Wang，2019）中。外泌体通过将含有蛋白质、核酸和脂质的各种货物从母细胞递送至受细胞，在许多重要的生物学过程中发挥着关键作用（Valadi等，2007；Budnik等，2016）。值得注意的是，肿瘤细胞分泌的外泌体显著多于正常细胞，这些肿瘤来源的外泌体（TEXs）携带肿瘤特异性生物分子（如表面蛋白和核酸），并积极塑造肿瘤微环境（Yá?ez Mó等，2015；Van Niel等，2018）。因此，TEXs已成为快速发展的液体活检领域中最有前景的生物标志物之一，为癌症诊断和治疗监测提供了无创途径（Yu等，2021，2022）。然而，由于其内在异质性和在体液中的极端稀缺性——通常占外泌体总群体的不到0.1%——在大量非肿瘤外泌体背景中精确鉴定和表征TEXs仍然是临床实践中一项艰巨的技术挑战。
外泌体表面蛋白和内部微小RNA（miRNA）是外泌体异质性的关键贡献者，也是癌症研究中研究最为广泛的标志物。Western blotting和酶联免疫吸附测定（ELISA）是检测外泌体蛋白的金标准。然而，这些传统技术通常需要大量样品才能分离足够的靶标进行分析，从而降低了灵敏度（Shao等，2018）。磁分离技术能够实现外泌体的快速高效捕获以用于蛋白检测（Zhang等，2023；Wu等，2022），但仍存在一个关键局限：检测信号往往分散在大量磁性材料上，限制了其在准确定量低丰度外泌体蛋白方面的应用。逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）被认为是测量外泌体miRNA的标准方法（Chevillet等，2014；Wu等，2019）。尽管灵敏，但所得结果是所有外泌体整体分子含量的平均值，单个miRNA分子与检测信号之间的直接一对一关联关系丢失，模糊了分子水平分辨率。TEXs中特定miRNA的极端稀缺性——范围从每百万个外泌体不到一个拷贝到每个外泌体一个拷贝（Preethi等，2022）——突显了对能够在单外泌体甚至单分子水平上分辨外泌体miRNA的快速超高灵敏检测方法的迫切需求，尤其是在常规临床癌症诊断中鉴定功能上不同的外泌体亚型方面（Qian等，2022；Feng等，2025）。
外泌体标志物检测领域已取得重要进展（Wei等，2024）。然而，由于生物分子的独特特性，目前TEXs的分子分析主要集中于单一类型的标志物——蛋白质或miRNA——限制了诊断信息的全面性（Zhou等，2020a；Gong等，2025）。同时检测双类型标志物，尤其是外泌体蛋白和miRNA的联合分析，在提高诊断精度和实现疾病进展动态监测方面具有巨大前景（Zhou等，2020b；Hsu等，2023；Lei等，2023）。例如，一种三维微流控芯片平台通过使用不同标记的量子点进行多重蛋白检测以及封装分子信标（MB）探针的病毒模拟融合囊泡进行灵敏miRNA检测，成功实现了胰腺癌的准确诊断（Xu等，2024）。同样，外泌体蛋白和microRNA一站式（ExoPROS）生物传感器也已被开发用于在抗体捕获外泌体后同时检测TEX特异性蛋白-miRNA对（Zhao等，2023）。在该系统中，miRNA通过表面等离子共振耦合的MB探针进行定量，其中每个靶标miRNA仅产生一个荧光信号，检测灵敏度不足以进行单分子分析。为克服这一局限，最近建立了一种数字双CRISPR-Cas驱动的单EV评估（ddSEE）系统，利用CRISPR-Cas12a和CRISPR-Cas13a的正交活性，在外泌体单水平同步检测蛋白和miRNA（Li等，2021）。这些CRISPR系统的强横截切割活性实现了强大的信号放大，允许从单个外泌体中获得同时多重读数。尽管如此，在此框架内实现miRNA检测的真正单分子灵敏度仍然是一个持续的挑战——这对于释放基于外泌体的液体活检在早期癌症检测和亚型分层中的全部潜力至关重要。
受单微珠限制效应——将微弱的检测信号在空间上集中于微体积中至少放大106倍——的启发，我们引入了一种单微珠限制的双模式检测系统，能够在单分子水平上同时超灵敏定量外泌体蛋白和miRNA。外泌体蛋白通过膜插荧光染料在外泌体被特异性捕获到单微珠上进行定量。然后温和裂解这些外泌体以释放其囊内miRNA，这些miRNA与一对肽核酸（PNA）探针杂交，形成空间限制的三明治复合物，确保单个miRNA与共价金纳米颗粒（AuNP）产生的衍射极限光散射斑点之间严格的一对一分子对应关系。通过对两类外泌体标志物的全面分析，我们的方法表明联合标志物能够精确区分乳腺癌患者和健康供体，优于任何单个标志物或其他组合，为癌症早期诊断和精确分型奠定了坚实基础。
章节摘要
材料与试剂
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化的琼脂糖微珠购自GE Healthcare Co., Ltd.（美国芝加哥）。链霉亲和素修饰的磁珠购自Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.（美国沃尔瑟姆）。三氯化金三水合物（HAuCl4·3H2O）购自Sigma-Aldrich Co., Ltd.（中国上海）。Tween-20、三钠柠檬酸三水合物、三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）、Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）、10 × PBS、吗啉代乙烷磺酸
单微珠限制系统的原理
鉴于乳腺癌的高分子异质性，其包含多个由肿瘤细胞分子谱定义的不同亚型，我们选择乳腺癌作为模型系统来评估我们平台的诊断能力。对于外泌体蛋白标志物，我们靶向上皮细胞粘附分子（EpCAM）和人表皮生长因子受体2（HER2），这两个在乳腺癌来源的外泌体中经常过度表达的成熟标志物（Liu等，2019；
结论
总之，我们开发了一种单微珠限制的双模式检测系统，用于选择性分离TEXs并同步定量外泌体蛋白和miRNA联合标志物。利用单微珠的信号富集能力和聚集AuNPs的强光散射信号，我们的系统无需RNA提取或扩增即可实现单分子miRNA检测。通过对外泌体蛋白-miRNA对的全面分析，我们的
CRediT作者贡献声明
罗志恒：撰写——初稿，方法学，调查，数据整理。张鹏博：撰写——审阅与编辑，监督，资源，方法学，资金获取，形式分析，数据整理。李慕：形式分析，数据整理。崔学健：形式分析。刘子萱：方法学，调查。张宝水：形式分析。王浩：形式分析。王芳芳：监督，方法学，资金获取。邱天：监督，数据整理。李正平：
利益冲突声明
作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金［22504004和22234001］、北京市自然科学基金［2254077］以及河北省中央引导地方科技发展基金［246Z2407G］的支持。
罗志恒|张鹏博|李慕|崔学健|刘子萱|张宝水|王浩|王芳芳|邱天|李正平
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