一种用于多重 miRNA 成像与乳腺癌分期的自增强 DNA 酶纳米机器

《Biosensors and Bioelectronics》：A Self-Reinforced DNAzyme Nanomachine for Multiplexed miRNA Imaging and Breast Cancer Staging

　　**摘要**微小RNA（miRNAs）精确调控复杂的基因调控网络，并作为疾病诊断的关键生物标志物。然而，同时监测细胞内多种miRNAs仍受限于递送效率低和信号增益不足。本文通过整合蜂窝状MnO?纳米海绵（hMNS）与miRNA响应型DNA酶系统，构建了一种自增强型DNA酶纳米机器（Dz@hMNS），用于在活细胞中同时可视化miR-21、miR-155和miR-10b。hMNS支架在遇到富含谷胱甘肽（GSH）的细胞内环境时，可高效地将miRNA响应型DNA酶系统递送入细胞，并释放Mn2?作为必需辅助因子，促进靶miRNAs激活报告探针的循环切割，从而产生放大的荧光信号。该自增强机制无需蛋白酶或外源扩增，对miR-21的检测限为50.13 fM，对miR-155为34.78 fM，对miR-10b为49.10 fM。通过同时分析三种miRNAs，该Dz@hMNS纳米机器能以100%的准确率（AUC = 1.000）区分乳腺癌患者与健康供体，并区分乳腺癌I-III期，优于单miRNA分析。此外，它能在活细胞中对多种miRNAs进行实时成像，交叉信号极小，且可重新编程用于检测其他RNA种类（如piRNAs、lncRNAs和circRNAs），在生物学研究和癌症诊断方面具有广阔的应用前景。**引言**微小RNA（miRNAs）是内源性非编码RNA，长度约为22个核苷酸，在细胞增殖、分化、凋亡和应激反应中发挥关键调控作用（Bartel 2009; Dong等 2013; Dvinge等 2013）。越来越多的证据表明，特定miRNAs的异常表达水平可能与多种人类恶性肿瘤有关，包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌和结直肠癌，甚至与不同肿瘤亚型的分类相关，使miRNAs成为癌症诊断、分期和预后评估的理想候选生物标志物（Iorio等 2005; Murakami等 2006; Tsujiura等 2010; Wang等 2015; Yanaihara等 2006; Yang等 2025）。miRNAs在复杂的调控网络中发挥作用，一个miRNA可调控数百个mRNAs，而多个miRNAs可协同调控单个mRNA的表达（Galka-Marciniak等 2021; Metcalf 2024; Wei等 2023; Zhang等 2025a）。此外，这些miRNAs的表达模式已被证实能反映细胞亚型分类和特定细胞遗传学特征（Deng等 2017; Li等 2023; Lu等 2005）。因此，在活细胞中对miRNAs进行多重成像有助于准确识别癌细胞类型和状态，为癌症诊断和预后提供了稳健的策略（Fu等 2026; Lu等 2005）。然而，由于miRNAs在生物体内丰度低且分子体积小，在活细胞中同时特异性成像多种miRNAs是一项巨大挑战（Li等 2014）。常规方法包括Northern印迹（Várallyay等 2008）、微阵列（Lee和Jung 2011; Thomson等 2004）、定量逆转录PCR（qRT-PCR）（Chen 2005）和新一代测序（NGS）（Keller等 2016），已被广泛应用于miRNAs分析。然而，这些方法存在细胞活力受损、操作繁琐、样品消耗量大和检测灵敏度差等不足，无法捕获活细胞内的时空信息（Chen 2005; Keller等 2016; Lee和Jung 2011; Thomson等 2004; Várallyay等 2008）。对于细胞内成像，传统荧光原位杂交（FISH）具有空间分辨率，但受限于放大效率低（Kishi等 2019）。近期，多种酶辅助扩增策略被应用于miRNAs检测，包括滚环扩增（Hu等 2018; Liu等 2016）、环介导等温扩增（Liu等 2025b; Zhang等 2021）、外切核酸酶III驱动循环扩增（Du等 2022）和双链特异性核酸酶介导循环扩增（Yin等 2012）。尽管灵敏度有所提高，但这些依赖酶的易在复杂细胞环境中失活，且需要严格的反应条件（如精确的温度和pH值），这不仅损害了其传感性能，也限制了其在活细胞成像中的适用性（Du等 2022; Hu等 2018; Liu等 2016; Liu等 2025b; Yin等 2012; Zhang等 2021）。另外，几种无酶扩增方法（如杂交链式反应（Yu等 2025; Zhang等 2022）、熵驱动电路（He等 2022; He等 2023）和催化发夹组装（Kim等 2024; Liu等 2022））被引入用于细胞内低丰度miRNAs的分析。然而，这些技术通常需要复杂的探针设计和多步组装过程。此外，对于多重靶标成像，复杂扩增组分的共存可能引发非预期的交叉反应和信号串扰，大大降低检测准确性。因此，迫切需要一种简单、高效且灵敏的方法来实现活细胞中多种miRNAs的同时成像。DNA酶，又称脱氧核糖核酸酶，是一类具有催化功能的核酸分子，具有合成和修饰简便、可编程识别臂、高底物特异性和低非特异性吸附等特点（McConnell等 2021; Nguyen等 2023; Schmuck等 2024）。在特定金属离子辅助因子存在下，它们可以模拟蛋白酶的催化功能（如DNA/RNA切割、连接和DNA磷酸化）（Borggrafe等 2022; Chen等 2017; Liu等 2017; Nurmi等 2026）。DNA酶的结构可编程性有助于构建多样化的生物分析平台，用于核酸（Zhai等 2025; Zhao等 2025）、金属离子（Lee等 2009）和酶（Han等 2024; Zhang等 2025b）的细胞内成像。有效的基于DNA酶的细胞内成像依赖两个关键因素：(1) DNA酶探针成功递送入细胞，以及(2) 在复杂细胞环境中可能不足的必需辅助因子的持续供应。然而，DNA酶探针由于其多聚阴离子性质和低酶稳定性，细胞摄取效率差，需要使用纳米载体实现高效的细胞内递送。蜂窝状MnO?纳米海绵（hMNS）作为一种新兴的三维（3D）纳米材料，由于其合成简便、比表面积大、低毒性和良好的生物相容性，在生物医学领域引起了广泛关注（Wei等 2020）。重要的是，hMNS能高效负载和运输各种货物分子（如DNA、RNA和蛋白质）进入细胞，并响应内源性谷胱甘肽（GSH）产生辅助因子以促进基于DNA酶的细胞内成像（Huang等 2022; Liu等 2025a）。本文通过简单地将miRNA响应型DNA酶系统共组装到蜂窝状MnO?纳米海绵（hMNS）支架上，构建了一种自增强型DNA酶纳米机器（简称Dz@hMNS），用于活细胞中多种miRNAs的同时成像。hMNS发挥两个核心作用：(1) 作为纳米载体将miRNA响应型DNA酶系统递送入细胞，以及(2) 作为Mn2?储库维持高效的DNA酶催化。三种miRNA响应型DNA酶探针（mDz）被专门设计分别靶向miR-21、miR-155和miR-10b，它们均与乳腺癌进展相关（Hu等 2025; Li等 2023）。在细胞内环境中，三种非活性mDz探针在与各自的miRNA靶标特异性结合后转变为活性结构。激活的mDz探针可在Mn2?存在下催化相应的报告探针进行循环切割，产生放大的荧光信号。值得注意的是，该自增强机制可在不依赖外源核酸扩增步骤的情况下进行，避免了传统扩增固有的复杂性和信号串扰。该Dz@hMNS纳米机器具有操作简便、稳定性好、特异性高和灵敏度高等特点，实现了fM水平的miRNAs一步多重检测。此外，该Dz@hMNS纳米机器还能在活细胞中对多种miRNAs进行实时可视化，甚至精确区分乳腺癌分期（I期、II期和III期）。**Dz@hMNS的构建**三种miRNA响应型DNA酶探针（mDz-21、mDz-155和mDz-10b）分别稀释至1 μM，随后在95 °C下退火5分钟形成稳定的发夹结构。然后，将20 μg·mL?1的hMNS、20 nM的miRNA响应型DNA酶探针（mDz-21、mDz-155和mDz-10b）和报告探针（100 nM Reporter-21、40 nM Reporter-155和40 nM Reporter-10b）在室温下共孵育20分钟制备Dz@hMNS。再加入HEPES缓冲液孵育20分钟。**Dz@hMNS纳米机器的工作原理**为了构建用于同时成像细胞内多种miRNAs的自增强型DNA酶纳米机器（Dz@hMNS），我们直接将miRNA响应型DNA酶系统组装在蜂窝状MnO?纳米海绵（hMNS）表面，无需复杂的化学偶联（Scheme 1A）。miRNA响应型DNA酶系统涉及六种合理设计的寡核苷酸：三种miRNA响应型DNA酶探针（即mDz-21、mDz-155和mDz-10b）和三种荧光基团标记的报告**结论**总之，我们构建了一种用于活细胞中多种miRNAs同时成像和乳腺癌分期的自增强型DNA酶纳米机器（Dz@hMNS）。该纳米机器通过简单的miRNA响应型DNA酶系统自组装到hMNS支架上实现，具有以下显著优势：(1) 多功能hMNS在富含GSH的肿瘤微环境中促进mDz探针的高效细胞内递送和充足的Mn2?辅助因子供应（Chen等**利益冲突声明**作者声明不存在竞争性经济利益。**作者贡献声明****张春阳：** 撰写 – 审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。**胡娟：** 验证，调查研究。**周宝梅：** 验证，调查研究。**宋瑞：** 撰写 – 原稿，方法学，调查研究，数据整理，概念构思。**刘文静：** 撰写 – 原稿，资金获取**未引用文献**Liu等, 2025c。**数据可用性**数据可按请求提供。**竞争性利益声明**? 作者声明他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。**致谢**本工作得到江苏省前沿技术研发计划（BF2024063）和江苏省优秀博士后人才资助计划（2025ZB595）的支持。宋瑞 | 周宝梅 | 刘文静 | 胡娟 | 张春阳东南大学化学化工学院，数字医学工程教育部重点实验室，南京 211189，中国