稳定同位素指纹分析表明，在藻类水解物与褐煤厌氧共消化过程中，乙酸裂解途径逐渐占主导地位，并可能存在煤介导的DIET现象

《Bioresource Technology》：Stable isotope fingerprinting suggests progressive acetoclastic dominance and potential coal?mediated DIET in algal hydrolysate?lignite anaerobic co?digestion

　　

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  藻类-褐煤共消化配合预活化接种物使CH₄产量最大化。
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  首次应用稳定同位素指纹技术解析藻类-煤炭产甲烷过程。
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  预活化选择性富集了电活性细菌梭菌属。
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  产甲烷卵形菌属和产甲烷杆菌属稳定共存并实现功能互补。
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  表观分馏因子证实了乙酸裂解通路的渐进性主导地位。

引言

应对气候变化、减少对传统化石燃料的依赖以及重构全球能源结构已成为紧迫的战略优先事项（Hu等，2025）。煤层气（CBM）作为最重要的非常规天然气资源之一，广泛分布于煤层及邻近砂岩地层中，但目前仍大量未被利用（Beckmann等，2019；Mayumi等，2016）。按成因划分，CBM可分为热成因型和生物成因型（Liu等，2022）。与热成因CBM相比，生物成因型一般埋藏较浅、形成时间较近，且更易开采（Zhang等，2025）。其形成依赖于微生物对煤的降解，低阶煤（如褐煤、风化褐煤和次烟煤）比高阶煤更容易受到微生物侵蚀，因而具有更大的生物成因CH₄产生潜力（Zhu等，2025）。然而，目前生物成因CBM的产气速率和总产量仍远低于商业化可行水平，亟需更有效的强化策略。

煤层不仅是储气库，还具有动态"地质生物反应器"的功能（Huang等，2017）。包括生物刺激和生物强化在内的微生物强化策略可以通过提高含气率和增强煤的孔隙率与渗透率来增加CBM产量（Bao等，2021）。藻类作为生物燃料原料引起了广泛关注，将其添加到厌氧系统中被认为是一种提高CH₄产量的有前景的方法（Diao等，2025）。将藻类引入煤层不仅可以提供大量和微量营养素，还能输送易于生物降解的可再生有机物质以激活土著微生物，从而推动化石能源向可再生天然气的转化（Huang等，2017）。此外，该过程还具有碳封存潜力，因为藻类通过光合作用固定的CO₂可以储存于地下。此前的研究表明，藻类-煤共消化可增加CH₄产量。Li等（2024）报告称，添加10%蓝藻显著改变了煤的微结构并促进了微裂缝的形成，使CH₄产量提高了1.74–2.66倍。Diao等（2025）发现，褐煤与蓝藻共发酵的CH₄产量比单独煤发酵高出535.59%。然而，这些研究主要关注产气性能的宏观优化，对藻类-煤共消化系统中的微生物互作机制和代谢通路动态关注不足，这阻碍了大规模应用的推进。

褐煤尤其适合作为研究直接种间电子传递（DIET）的介质，因为其固有的导电矿物成分，包括黄铁矿和部分石墨化碳质组分，可能充当共生细菌与产甲烷古菌之间的非生物电子通道，其作用类似于工程化厌氧系统中的生物炭或磁铁矿颗粒（Wang等，2025；Zhao等，2025）。DIET在产甲烷过程中起着关键作用（Chen等，2025）。在该过程中，共生细菌提供的电子传递给产甲烷古菌，随后进入细胞内产甲烷途径，由辅酶F₄₂₀和甲基辅酶M还原酶等催化终末转化为CH₄。然而，在藻类-褐煤共消化系统中，藻类和煤组分如何调节DIET以增强产甲烷仍有待阐明。与此同时，稳定同位素指纹技术作为一种原位分析工具，能够将分子尺度的微生物代谢活动与可观测的地球化学表型联系起来，已被应用于农业土壤、湿地和湖泊沉积物等环境中的产甲烷途径表征（Conrad，2005；Gehring等，2015；Nikolausz等，2013）。然而，该技术尚未应用于藻类-煤共消化系统，导致此类系统中的主导产甲烷途径尚未明确。

值得注意的是，微生物群落分析和稳定同位素指纹技术在机制解析方面相互补充但本质不同。群落分析揭示了功能类群的丰度和结构，表明了潜在的代谢能力。然而，丰度并不等同于活性，仅靠组成数据无法确认通路活性或量化通量（Vinson等，2017）。相比之下，稳定同位素特征（CH₄和CO₂的δ¹³C和δD）整合了净微生物活性，并能够区分主导产甲烷途径及其贡献（Nikolausz等，2013；Yue等，2021）。因此，两种方法相互印证。重要的是，仅凭δ¹³C-CH₄无法可靠地区分产甲烷途径，因为它受底物同位素组成变异、乙酸发酵过程中碳分配以及途径混合的影响。δ¹³C-CH₄与δD-CH₄的组合提供了互补的见解，因为氢同位素分馏在乙酸裂解型和氢营养型产甲烷之间存在差异。加入δ¹³C-CO₂后，可以根据CO₂和CH₄之间的同位素关系计算表观分馏因子（α_c），该因子可作为通路识别的更可靠指标（Whiticar，1999）。

本研究搭建了实验室模拟煤层生物反应器，评估并比较了分别以褐煤、藻类水解物和两者组合为底物的系统的产甲烷性能，特别着重于探索藻类-褐煤共消化系统潜在的机制。采用稳定同位素指纹技术（δ¹³C-CH₄、δD-CH₄、δ¹³C-CO₂）解析产甲烷途径，并追踪藻类水解物添加如何调节厌氧消化过程中的碳流向。通过整合分析可溶性代谢中间产物、关键酶活性、体系理化性质以及褐煤结构变化，进一步表征了藻类水解物对生物成因CH₄产生的影响。本研究的结果为应用生物强化策略提高生物成因CBM产量以及推进可持续、低碳的煤炭利用提供了机制基础和实践指导。

章节摘要

底物与接种物制备

本研究选用满拉赖褐煤（中国内蒙古）作为共消化底物。使用前，将褐煤干燥、破碎、研磨，然后通过60目（250 μm）筛网。按中国国家标准（GB/T 212-2008；GB/T 214-2007；GB/T 476-2008）对褐煤样品进行工业分析、元素分析和显微组分分析，结果见补充材料。蓝藻购自青治环保

CH₄、CO₂和COD的变化

图1展示了不同底物对累计CH₄产量、CO₂产量和COD浓度的影响。CK组、N组和O组的累计CH₄产量呈三阶段模式：滞后期、指数产气期和稳定期（第21–65天），尽管各组前两阶段的持续时间有所不同（图1a）。BK组在整个培养期间的CH₄产量始终最低，缓慢积累至最终产量仅达7–8%

结论

本研究证明，微生物接种物预活化结合藻类水解物添加显著提高了CH₄产量。O组实现了最高的CH₄产量（1400.68 μmol/g COD）并缩短了滞后期。O组选择性富集了电活性细菌梭菌属，其与导电煤颗粒可能共同促进了从共生细菌到产甲烷古菌的直接种间电子传递（DIET）。O组具有最高的辅酶

CRediT作者贡献声明

徐彤彤：撰写–审阅与编辑，撰写–初稿，可视化，验证，方法论，调查研究，形式分析。李萌萌：撰写–初稿，可视化，验证，方法论，调查研究，形式分析，数据整理。尹晚荣：撰写–初稿，调查研究，形式分析。张威婷：撰写–审阅与编辑，验证，形式分析。吴昌昊：撰写–审阅与编辑，验证，调查研究。黄在兴：撰写

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

致谢

我们感谢怀俄明大学稳定同位素核心设施（RRID:SCR_028269）的Chandelle Joan Macdonald进行同位素分析。

徐彤彤|李萌萌|尹晚荣|张威婷|吴昌昊|黄在兴|何寰|Michael Urynowicz|郭宏光|刘芳靖|Asif Jamal|Muhammad Ishtiaq Ali|Rizwan Haider