成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）相关（Cas）系统最初被鉴定为细菌和古菌中的适应性免疫机制，由于其可编程靶向性和高保真识别能力，彻底改变了核酸检测领域（Barrangou and Doudna, 2016; Kaminski et al., 2021; Pickar-Oliver and Gersbach, 2019）。其核心机制依赖于CRISPR RNA（crRNA）引导的Cas蛋白，以单核苷酸精度选择性结合靶标DNA或RNA，随后激活其反式切割活性（Wang et al., 2020）。
CRISPR/Cas系统分为两大类：I类（I型、III型和IV型）和II类（II型、V型和VI型）（Barrangou and Horvath, 2017; Jackson et al., 2017）。I类CRISPR系统通过多亚基效应复合体协调核酸识别和催化切割。在此机制中，监测复合体首先识别并结合靶序列，随后招募专门的核酸酶（如Cas3或Cas10）执行靶标降解。相反，II类CRISPR系统具有单一的多结构域效应蛋白，集靶标识别与切割功能于一体。Cas9、Cas12、Cas13和Cas14等效应蛋白在crRNA的引导下识别互补的DNA或RNA序列，随后催化序列特异性切割事件，是核酸检测的高效工具（Xu et al., 2020）。与传统的核酸扩增方法不同，后者往往存在非特异性扩增、复杂的引物设计和气溶胶污染等问题，基于CRISPR的检测利用Cas12和Cas13等Cas效应蛋白的反式切割活性，在等温且无引物条件下产生放大信号（Aman et al., 2020; Broughton et al., 2020; Hillary and Ceasar, 2023; Peng et al., 2020; Xia et al., 2021）。这些特性结合室温操作和与便携式读取设备的兼容性，使基于CRISPR的检测方法在现场即时检测（POCT）中尤为具有吸引力（Abudayyeh and Gootenberg, 2021; Mohammad et al., 2022）。
尽管具有独特优势，但无需核酸预扩增的CRISPR检测的检出限（LOD）通常仅能达到皮摩尔水平。这种灵敏度不足以捕获低丰度生物标志物，从而限制了其在关键应用中的实用性，包括早期临床诊断、潜伏感染监测以及痕量环境污染物监测（Huyke et al., 2022; Li et al., 2023a; Yin et al., 2021）。因此，在飞摩尔或阿摩尔水平上实现稳健且特异性的检测仍然是迫切的未满足需求（Chen et al., 2020; Li et al., 2022; Yuan et al., 2021）。为弥补这一差距，级联CRISPR系统作为一种有前景的解决方案应运而生（Li et al., 2023b）。这些系统通过整合顺序酶促步骤或CRISPR模块来放大检测信号，从而避免靶标预扩增。其核心原理依赖于一种酶促反应直接触发或放大另一种反应，从而形成自传播的信号级联（Gootenberg et al., 2018）。该策略不仅提高了灵敏度，还保留了基于CRISPR的检测方法简单、可编程和易使用的特点。
在本综述中，我们首先概述了级联CRISPR系统的基本原理和代表性架构，涵盖酶偶联级联、多效应蛋白II类CRISPR级联和I类III型CRISPR基础级联。我们详细介绍了这些集成系统如何利用酶促级联来绕过核酸预扩增的需求，从而实现高灵敏度生物标志物检测。随后，我们重点阐述了这些级联在检测疾病生物标志物、病原体感染以及食品和环境污染检测中的最新进展（图1）。最后，我们探讨了当前挑战和展望，包括与便携式平台的整合以及人工智能引导的系统优化。
