金黄色葡萄球菌分离株中VII型分泌系统（T7SSb）蛋白的基因组分析——来源包括生肉、加工肉制品及食用动物兽医样本

《Bacteria》：Genomic Analysis of the Type VII Secretion System (T7SSb) Proteins in Staphylococcus aureus Isolates from Raw Meat, Processed Meat Products and Veterinary Samples of Food-Producing Animals

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）产生一系列毒力因子（Virulence Factors，VFs），从而促进其致病性。其中一种VFs是VII型分泌系统（Type VII Secretion System，T7SS），这是一种存在于许多革兰氏阳性菌中的蛋白质分泌装置，在感染起始阶段发挥重要作用。本研究旨在调查从生肉、加工肉制品及食用动物兽医样本中分离的S. aureus中T7SS的分泌型效应蛋白和核心结构蛋白的存在情况。研究人员采用全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）和生物信息学工具分析了S. aureus（n=27）分离株。结果显示，所有调查的27株分离株均携带T7SS_b编码的多种基因：分泌型效应蛋白（EsxA和EsxB）和核心结构蛋白（EssA、EssB、EssC、EsaA和EsaB）。观察到某些基因的存在与缺失，但总体而言，所有分离株均携带主要蛋白EssC。这些分离株中发现的EssC C末端是保守的，并且它们聚集在EssC1和EssC3变体之间。拉氏图（Ramachandran plot）验证和预测表明T7SS_b蛋白具有稳定性和可能的功能保守性。对蛋白质-蛋白质相互作用、跨膜结构域和二级结构的分析提供了对T7SS_b组装以及各种蛋白质如何相互作用的深入理解。结果显示，分离株含有一系列T7SS_b蛋白，表明存在与多种人类感染相关的蛋白，这凸显了持续监测计划和对S. aureus菌株调查的实际应用。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）是一种重要的人兽共患病原体，能够在人类、食用动物、环境储库和食品链等多样生态位中定植，其致病性依赖于大量毒力因子（Virulence Factors，VFs）。其中，VII型分泌系统（Type VII Secretion System，T7SS）是多种革兰氏阳性菌中的蛋白质分泌装置，在感染启动中起关键作用。目前，针对食品-动物-人类界面上S. aureus分离株中T7SS的基因组组织、结构保守性和功能潜力的数据仍有限，尤其在中低收入国家。因此，本研究采用全基因组测序（Whole-Genome Sequencing，WGS）和整合生物信息学分析，对来自南非多个省份、时间跨度为1964年至2019年的生肉、加工肉制品和食用动物兽医样本中分离的27株S. aureus进行T7SS_b分泌效应蛋白和核心结构蛋白的表征。该论文发表在《Bacteria》期刊上。

研究人员主要使用了以下关键技术方法：使用PROKKA v1.13.7进行基因组注释；采用BLASTp、InterProScan和SMART数据库鉴定蛋白结构域和保守基序；利用MUSCLE比对和FastTree构建EssC C末端系统发育树；通过ProtParam计算理化参数；使用STRING v12.0构建蛋白质-蛋白质相互作用网络；运用TMHMM、Phobius和DeepTMHMM预测跨膜拓扑结构；最后通过SWISS-MODEL进行三维（3D）结构建模，并以拉氏图和MolProbity评分评估模型质量。

研究结果部分：3.1 T7SS_b毒力基因的生态分布——通过前期基因组分析，所有27株分离株均携带编码核心结构蛋白（essC、essA、essB、esaA、esaB）和分泌效应蛋白（esxA、esxB）的基因，表明该分泌系统在不同生态位和长期时间跨度内稳定存在。3.2 T7SS_b蛋白结构域与基序鉴定——蛋白结构域注释确认EssC含有Pfam：FtsK_SpoIIIE_N域，EssA含有EssA域，EssB含有YukC域，EsaA含有DUF3149域，EsaB含有YukD域，而EsxA和EsxB均含有WXG100域；SMART验证显示所有蛋白与NCBI参考蛋白具有100%查询覆盖率和100%序列一致性，且E值极低（0至10^-105），证实这些蛋白是典型且高度保守的。3.3 EssC C末端序列变异与系统发育分析——WebLogo可视化显示C末端序列高度保守，仅有微小变异；系统发育树显示大多数分离株聚成一个主要分支，并与EssC1和EssC3变体聚类，而非EssC2和EssC4，表明分离株主要携带EssC1和EssC3两种变体。3.4 理化性质表征——EssC是最大的蛋白（1479个氨基酸，约170.9 kDa），EsaB最小（80个氨基酸，9.12 kDa）；GRAVY分析表明六个蛋白亲水性，仅EsaB疏水；不稳定指数显示EssC、EssB、EsaA、EsaB和EsxB稳定，而EssA和EsxA不稳定；所有蛋白的脂肪指数范围为71.55-127.88，提示保守的热稳定性。3.5 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析——以EssC为查询蛋白，STRING数据库预测出包含11个节点的网络，其中不仅包括核心蛋白EssB、EssA、EsaA、EsxA，还检测到EssG、EssE及两个假设蛋白；BLASTp分析发现其中一个假设蛋白（ABD29726.1）与本研究注释蛋白CCMAFFEN_00285高度相似（90.19%序列一致性，95%查询覆盖率，E值为0），而ABD29434.1未被发现。这些强相互作用表明T7SS_b各组件在生物学水平上协同运作。3.6 跨膜结构域与拓扑分析——分泌效应蛋白EsxA和EsxB无跨膜结构域，符合其分泌后胞外定位的特征；核心结构蛋白中EsaA含6个预测跨膜螺旋，EssC含3个，EssA和EssB各含1个，反映它们在膜锚定和分泌装置形成中的整合作用。3.7 三维结构建模——SWISS-MODEL生成的EssC和EsaA模型具有高置信度，MolProbity得分分别为0.73和0.56，冲突分数分别为0.21和1.25（理想值低于10-15）；拉氏图显示EssC和EsaA分别有97.16%和95.13%的残基位于最适区域，离群值仅为0.14%和0.89%，表明模型高度稳定。3.8 3D结构质量评估——所有七个蛋白的MolProbity得分范围为0.61-1.25，>88%的残基位于有利区域，证实预测结构的稳健性和可靠性。

讨论部分：研究人员指出，T7SS_b基因在所有分离株中的普遍存在表明该分泌系统是S. aureus的核心毒力特征，而非随机获得的附属性状。食品生产链中完整T7SS_b装置的保留可能赋予细菌在竞争、应激耐受或人兽共患传播中的选择优势。EssC C末端变异与克隆谱系相关，例如SA9-ST96、SA32/SA128-ST96-t2802等菌株聚类，提示共同进化祖先。蛋白结构域和理化分析进一步支持T7SS_b组件的功能完整性。蛋白质-蛋白质相互作用和跨膜拓扑分析表明T7SS是整合的功能单元，破坏单一组分可能损害系统功能。从“One Health”视角看，这些结果强调基因组监测应扩展至毒力相关系统，而不仅限于耐药性分析。研究存在样本量小、完全计算预测等局限性。

研究结论：该研究描述了一种整合计算方法，用于分析来自生肉、肉制品和食用动物兽医样本的S. aureus分离株中T7SS_b的分泌效应蛋白和核心结构蛋白。据研究人员所知，这是南非首次采用这些方法报道T7SS_b蛋白。该研究表明，S. aureus T7SS_b的分泌效应蛋白通过作为毒力毒素发挥细菌竞争作用，并通过调节宿主免疫反应促进感染性疾病。3D结构建模和拉氏图验证增强了对蛋白质生物学功能的理解。然而，尽管对S. aureus中T7SS_b核心装置结构和作用的认识有所增加，未来仍需在更大样本量、多样化样本类型和广泛地理范围内开展研究。除毒力和细菌间拮抗外，T7SS可能具有的其他基于基因组的特征也是未来研究的有趣方向。预期该技术将被广泛应用于多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的蛋白质研究。