多孔膜吸附捕获小细胞外囊泡实现可及的单颗粒分析

《ACS Applied Materials & Interfaces》：Porous Membrane Adsorption for Capturing Small Extracellular Vesicles Enables Accessible Single-Particle Analysis

　　

由于小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）的纳米级尺寸和组成异质性，在单颗粒分辨率下对其进行的定量分析仍然具有挑战性。现有方法通常依赖专业且昂贵的仪器，限制了众多研究者的可及性，并需要进行大量优化。在此，研究人员提出了一种用于捕获小囊泡的多孔膜吸附方法（porous membrane adsorption for capturing small vesicles, PMACS），该方法采用多孔阳极氧化铝（anodized aluminum oxide, AAO）膜作为纳米级隔室，在空间上分离单个囊泡。这使得无需先进设备或专业技能，即可使用标准宽场荧光显微术实现可及的单颗粒分辨。单颗粒分辨基于以下原理实现：根据泊松分布，AAO膜每个孔内最多容纳一个囊泡，且被占据的孔之间的间距超过光学分辨率极限，从而确保荧光斑点可靠地归属于单个囊泡。PMACS能够在宽动态范围（10³至10⁶颗粒/μL）内实现对培养细胞来源sEVs的可靠定量。该性能超越了传统方法，且无需先进仪器或专业操作。研究人员证明，PMACS通过评估培养细胞来源sEVs（Hela、A549和HEK293T细胞系）的四旋蛋白（CD9、CD63和CD81）群体，能够进行sEV货物共定位分析。通过简单易用的装置即可可视化sEVs上的异质性蛋白表达。由于其简单性、灵敏度和可及性，PMACS为推动sEV异质性研究和扩大sEV科学的参与度提供了一个实用平台。

**研究背景与概述**

几乎所有真核细胞都会分泌由脂质双分子层包被的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），其内部包裹蛋白质、核酸及其他代谢物。EVs根据生物发生途径可分为外泌体、胞外体（微囊泡）等多个亚群；在未明确生物发生途径时，通常采用尺寸依赖性命名，即小细胞外囊泡（small EVs, sEVs；<200 nm）和大细胞外囊泡（>200 nm）。sEVs自2007年被证实可通过递送货物介导细胞间通讯以来，已被广泛研究并确认参与癌症进展、感染过程、神经退行性疾病及伤口愈合等关键生物学事件。sEVs的货物（如miRNA和蛋白质）可反映分泌细胞的代谢状态，因此货物分析技术对于理解其病理机制和开发临床诊断工具至关重要。然而，传统分析方法（ELISA、Western blotting、RNA-seq等）仅呈现样品中所有颗粒的平均值，无法捕获sEVs的异质性群体。现有单颗粒分析技术如纳米颗粒追踪分析（NTA）、纳米流式细胞术（nFCM）和单颗粒干涉反射成像传感器（SP-IRIS）虽可实现单颗粒表征，但依赖昂贵专用仪器且需专业技能，且仅在较窄浓度范围内提供可靠结果，限制了其在一般生物学研究中的普及。因此，亟需一种简便易用且可及的单颗粒分析方法。

针对上述技术瓶颈，研究人员开发了一种基于多孔阳极氧化铝（anodized aluminum oxide, AAO）膜吸附捕获小囊泡的方法（porous membrane adsorption for capturing small vesicles, PMACS），利用商业化的AAO膜（孔径约200 nm）作为纳米级隔室，在空间上隔离单个sEVs，从而仅需标准宽场荧光显微术即可实现单颗粒分辨。该方法以荧光标记脂质体完成概念验证，并成功应用于多种细胞系来源sEVs的定量检测与四旋蛋白共定位分析。论文发表在《ACS Applied Materials》。

**关键技术方法**

研究人员采用的主要技术方法包括：以荧光标记脂质体（Rhd-liposomes，平均直径约100 nm）作为模型囊泡验证PMACS概念；从Hela、A549和HE