《Journal of the American Chemical Society》：Mitochondrial Dyes with Balanced Permeability-Fixability for Live, Fixed, and Expanded Multicellular Imaging
编辑推荐：
线粒体内膜超微结构在细胞代谢、衰老和细胞死亡中具有核心作用。然而，固定后线粒体的超分辨率成像仍具挑战：市售可固定探针常缺乏足够反应活性以在固定时强保留，而前沿探针PKMO FX虽固定效率高，却因引入高亲水基团导致细胞渗透性差。研究人员通过酰胺到酯取代策略克服“
线粒体内膜超微结构在细胞代谢、衰老和细胞死亡中具有核心作用。然而，固定后线粒体的超分辨率成像仍具挑战：市售可固定探针常缺乏足够反应活性以在固定时强保留，而前沿探针PKMO FX虽固定效率高，却因引入高亲水基团导致细胞渗透性差。研究人员通过酰胺到酯取代策略克服“渗透性-可固定性权衡”，报道线粒体探针PK Mito 590 FIX和PK Mito 647 FIX：其利用优化脂溶性酯键实现快速线粒体标记（10分钟内），并具备优异醛类交联效率（信号保留>90%）。该分子工程使从活细胞动态到固定后超分辨显微镜（STED）无缝过渡，信背比空前。增强的渗透性解锁多细胞样本固定后成像，可观察患者来源细胞簇和小鼠分离胰岛内线粒体架构。研究人员进一步证明探针耐受扩张显微术（ExM）聚合条件，使标准共聚焦平台也能解析线粒体超微结构。该工具桥接生理动态与结构定义，为贴壁细胞及复杂多细胞系统中线粒体生物学多尺度研究提供通用平台。
研究背景方面，线粒体内膜，尤其是嵴（cristae）的架构动态重塑与代谢需求、应激和疾病密切相关。超分辨率显微镜（super-resolution microscopy，SRM），如受激发射损耗显微镜（stimulated emission depletion，STED），能解析亚衍射结构。将活细胞线粒体动态与固定后超微结构关联的“活到固定（live-to-fixed）”范式，依赖化学固定保存生理状态并实现下游高分辨成像。但现有探针存在明显短板：传统MitoTracker虽含可固定苄基氯，固定后信号流失严重；研究人员此前开发的PKMO FX借助胺-醛交联可存活于固定，但因引入亲水胺而膜渗透性差，难以进入患者来源肿瘤样细胞簇、类器官、组织等致密多维屏障样本。因此，亟需兼顾生物可利用性与化学可固定性的线粒体染料。
研究人员通过开展酰胺到酯（amide-to-ester）取代并优化胺连接子疏水性，构建以Cy3.5和ATTO647N为荧光团的酯键候选库，筛选出PK Mito 590 FIX（590-EH）与PK Mito 647 FIX（647-EP），系统评估活细胞渗透、固定保留、超分辨成像、多细胞样本、免疫多重着色及扩张显微术兼容性，得出结论：脂溶性酯键同时提升被动扩散速率与固定时胺基和戊二醛（glutaraldehyde，GA）交联机会，使活细胞快速标记、固定后信号高保留、信背比显著高于PKMO FX，并可扩展至患者来源肿瘤样细胞簇（patient-derived tumor-like cell clusters，PTCs）、小鼠分离胰岛、原代血管基质细胞等生理相关模型；探针还能承受扩张显微术的聚丙烯酸凝胶聚合与蛋白水解步骤，用标准共聚焦即可读线粒嵴。该研究发表于《Journal of the American Chemical Society》，意义在于打破“可固定必低渗透”的权衡，为药物筛选、细胞器互作和多细胞系统线粒体异质性研究提供易用工具。
主要关键技术方法如下：基于亲脂性预测的候选库设计；活细胞与GA固定后共聚焦定量；与MitoTracker共定位及FCCP去极化外排实验；Triton X-100处理后荧光保留以验证共价交联；STED与Hessian结构光显微镜（Hessian-SIM）超分辨成像；患者来源肿瘤样细胞簇与小鼠分离胰岛等多细胞样本z轴层扫三维重建；扩张显微术（iterative ultrastructure ExM，iU-ExM）单轮膨胀；膨胀前小分子预染与膨胀后免疫荧光多重成像。
研究结果部分保留小标题并简述如下。
Design and Optimization of the Fixable Mitochondrial Dyes：研究人员用cLogP预测苯/环己烷间隔子经酯键偶联比酰胺更脂溶，结合Cy3.5与ATTO647N构建候选；结论是脂溶性连接子设计是可固定线粒体染料优化的有效起点。
Linker Engineering Generally Boosts Cell Permeability and Post-fixation Retention of Mitochondrial Probes：通过HeLa细胞不同染色时长共聚焦定量，酯键染料信号显著高于酰胺对应物，590-EH与647-EP在GA固定后保留94%与83%，Triton处理仍保留约72%与86%，FCCP实验显示脂溶性延缓去极化外排；结论为酯键普遍提升活细胞渗透与固定后保留，并确证为共价交联而非物理包埋。
PK Mito 590 FIX and 647 FIX Enable STED Imaging of Mitochondrial Ultrastructure in Fixed Cells：在HeLa、COS-7、HT22、原代血管基质细胞等实现固定后STED/Hessian-SIM嵴解析；erastin致线粒体圆胀、Mdivi-1致网络延长，且与HaloTag/KDEL、TMP/eDHFR自标记系统双色兼容；结论为探针非侵染、适用于药害形态学与多色超分辨。
Imaging of Fixed Mitochondria in Multicellular Systems：在患者来源肿瘤样细胞簇中647 FIX穿透更深、三维重建显示层间异质；小鼠分离胰岛中590 FIX渗透更佳，信背比约6.5×；结论为优化渗透使3D样本固定后线粒架构清晰、聚集假象少。
Multicolor Super-Resolution Imaging of PK Mito 590/647 FIX Combined with Immunolabeling：GA固定后透膜并与TOM20、TFAM、tubulin、COX IV、LAMP1、F-actin等抗体共标，STED下线粒体与细胞骨架、内质网、溶酶体关系可多重呈现；结论为小分子预染与免疫荧光流程兼容。
PK Mito 590/647 FIX are Compatible with Expansion Microscopy：iU-ExM单轮膨胀约6.6–7.2倍，647 FIX保信号56%、590 FIX保25%，膨胀后共聚焦即可分辨U-2 OS致密嵴，也可与抗tubulin、抗TOM20及pan-protein标记双色；结论为探针耐受ExM，使标准共聚焦做嵴级成像。
讨论与结论翻译部分：研究人员在结论中指出，通过酰胺到酯取代和胺连接子优化，PK Mito 590 FIX与PK Mito 647 FIX相较PKMO FX显著提升活细胞标记动力学与信背比，并在固定后保留优异；其可成像从贴壁细胞到患者来源簇、小鼠胰岛等多细胞系统，并兼容自标记标签、免疫荧光与扩张显微术。未来方向包括：光谱扩展出黄绿与近红外（NIR）变体；增强与甲醛（formaldehyde，FA）流程兼容；改造以适配单分子定位显微镜（single-molecule localization microscopy，SMLM）光开关；进一步解析脂溶性、微环境与聚集行为机制；将酰胺到酯策略推广至其他细胞器荧光探针。该工作为生理与病理背景下线粒体生物学研究提供了可普及的多模态平台。
