《Journal of the American Chemical Society》：Ubiquitin Chloromethylketone Probe Enables Activity-Based Protein Profiling of E2 Ubiquitin Conjugating Enzymes
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泛素（Ub）结合酶（E2）是Ub信号通路的核心，但其系统性活动态分析仍具挑战，因为该类酶催化半胱氨酸亲核性弱且pKa升高。现有Ub探针主要靶向去泛素化酶（DUB），唯一已报道的E2靶向探针需依赖E1激活以捕获有限E2。为广泛分析E2，研究人员报道了Ub氯甲基酮
泛素（Ub）结合酶（E2）是Ub信号通路的核心，但其系统性活动态分析仍具挑战，因为该类酶催化半胱氨酸亲核性弱且pKa升高。现有Ub探针主要靶向去泛素化酶（DUB），唯一已报道的E2靶向探针需依赖E1激活以捕获有限E2。为广泛分析E2，研究人员报道了Ub氯甲基酮（UbCMK）这一独立活动态探针。密度泛函理论（DFT）计算确认CMK是高度亲电的弹头（warhead），与弱亲核硫醇盐反应活化能垒低。UbCMK通过活化的半胱氨酸基蛋白质连接（ACPL）合成，并不可逆标记多种E2与半胱氨酸DUB。在HEK293T细胞裂解液中进行活动态蛋白质分析（ABPP）与定量蛋白质组学，显示对E2酶广泛富集，包括许多其他探针无法触及者。UbCMK还可活动依赖地量化内源E2在氧化、蛋白毒、炎症、代谢、脂质氧化及基因毒应激下的动员。此外，UbCMK也可结合E1与DUB，表明其作为探针用途广泛。这些结果确立UbCMK为强力化学工具，拓展Ub-蛋白酶体系统（UPS）中ABPP覆盖，并支持生理与病理条件下E2酶的功能解析。
研究背景方面，泛素（Ubiquitin，Ub）经E1激活酶（Ub activating enzyme E1）、E2结合酶（Ub conjugating enzyme E2）与E3连接酶（Ub ligase E3）级联共价连接到底物，调控蛋白定位、稳态与降解，该Ub-蛋白酶体系统（Ub-Proteasome System，UPS）失衡与多种疾病相关，蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）也依赖此系统。已有Ub探针如Ub醛、Ub腈、Michael受体、脱氢丙氨酸（dehydroalanine，DHA）探针多偏向去泛素化酶（deubiquitinase，DUB），其中UbDHA需E1激活才能接近E2，且不同细胞E1水平差异使分析复杂；E2催化半胱氨酸pKa约10.5、亲核性弱、与Ub结合弱，导致常规弹头难以捕获。E2异常与肿瘤进展、基因组稳定、免疫逃逸相关，因此亟需通用E2活动态蛋白质分析（activity-based protein profiling，ABPP）探针。研究人员提出并以密度泛函理论（density functional theory，DFT）指导设计Ub氯甲基酮（Ub chloromethylketone，UbCMK），用活化的半胱氨酸基蛋白质连接（activated cysteine-based protein ligation，ACPL）制备FLAGUbCMK、FLAGUbPA与FLAGUbFMK，证明CMK弹头亲电性强、活化能低，可独立、不可逆标记E2与半胱氨酸DUB，在HEK293T细胞裂解液中广泛富集E2，并在氧化、蛋白毒、炎症、代谢、脂质氧化、基因毒等应激下量化内源E2动员；该文发表于《Journal of the American Chemical Society》。
关键技术方法方面，研究人员以HEK293T细胞裂解液为样本，采用ACPL合成C端弹头化Ub探针；用DFT在M06-2X/6-311+G(d,p)与PCM溶剂模型下比较弹头亲电性与活化自由能；用SDS-PAGE、抗FLAG免疫印迹与碘乙酰胺封闭验证催化半胱氨酸参与；用抗FLAG磁珠免疫沉淀结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）做ABPP定量蛋白质组学；用UbPA预消耗竞争实验区分CMK专属靶群；用重组E1-E2-FLAGUb重建级联评估抑制；用二酰胺、MG132、poly(I:C)、2-脱氧-D-葡萄糖、过氧化亚硝基氧化LDL、依托泊苷等应激处理细胞后做内源E2活动捕获。
UbCMK as a Potential ABPP Probe for E2 Enzymes Based on DFT Calculation部分，研究人员计算氮杂肽酯、丙炔胺、乙烯基砜与氯甲基酮（chloromethylketone，CMK）对硫醇盐的亲电性（Fukui函数）与吉布斯自由能活化能，结果显示CMK羰基碳亲电性最高且加成活化能显著更低，因此选定CMK作为E2弱亲核半胱氨酸的弹头。
Synthesis of FLAGUbPA and FLAGUbCMK部分，研究人员以N端FLAG、G76C突变与C端6×His的Ub1-75-Cys蛋白为底物，经NTCB活化半胱氨酸后与3-氯-2,2-二乙氧基丙胺等小分子胺偶联，再酸解脱保护得到FLAGUbCMK与FLAGUbFMK，FLAGUbPA按已发表流程合成；电喷雾电离质谱（ESI-MS）分子量与理论值偏差≤0.3 Da，圆二色（CD）光谱显示探针保持天然二级结构。
Validation of FLAGUbCMK as an E2 Covalent Probe部分，重组UBE2M与UBE2C分别和FLAGUbCMK孵育产生更高分子量加合物，FLAGUbPA与FLAGUbFMK基本无反应，5 mM碘乙酰胺预处理催化半胱氨酸后加合物消失，证明CMK通过E2催化半胱氨酸形成共价标记。
Validation of FLAGUbCMK as a General Covalent Probe for DUBs部分，对UCH、USP、Josephin、OTU家族10种半胱氨酸DUB测试，三种探针均可标记，FLAGUbCMK反应广度与强度总体不低于FLAGUbPA且常更强，FLAGUbFMK较弱，说明CMK弹头对DUB与E2均适用。
Characterization of FLAGUbCMK Covalent Complexes with UPS Enzymes部分，以UBE2D2为模型，FLAGUbCMK形成硫甲基酮（thiomethylketone）硫醚加合物；37 °C 24 h、最高80 °C 60 min、1–10 mM谷胱甘肽存在下基本稳定，100 °C略降，碘乙酰胺预处理完全阻断，证明该加合物在时间、温度与还原环境下稳定，适合ABPP。
Activity-Based Protein Profiling Using FLAGUbCMK部分，HEK293T裂解液中FLAGUbCMK比FLAGUbPA标记条带更多更强；以非FLAG的UbPA预消耗12 h后再用FLAG探针标记，FLAGUbPA几乎全失活，FLAGUbCMK仍保留25 kDa附近及50–100 kDa强带，说明CMK可及UbPA不能触及的酶群。LC-MS/MS在UbPA耗竭后鉴定到22个E2（占人类E2约一半），包括UBE2D1/D2/D3/D4、UBE2E1/E2/E3、UBE2M、UBE2N、UBE2T等，以及E1（UBA1、UBA2）、UFM专用E2（UFC1）与多种DUB；火山图显示17个E2在FLAGUbCMK/FLAGUbPA中显著富集。
Validation of E2 Enzymes Identified from the Proteomic Analysis as FLAGUbCMK Targets部分，免疫沉淀加E2特异抗体确认UBE2D2、UBE2D3、UBE2E1、UBE2E3、UBE2K、UBE2L3、UBE2L5、UBE2M、UBE2N、UBE2T与探针成复合物；体外重组十种E2均形成更高分子量加合物，UBE2T较慢，UBE2E1/E3/L5近定量消耗探针。对UbDHA不反应的UBE2F、UBE2I、UBE2L6、UBE2Z，FLAGUbCMK也能形成加合物，拓展E2覆盖。
FLAGUbCMK as a Probe for E1 with an Active Site Cysteine部分，蛋白质组检出UBA1与UBA2；重建UBE1、ATP、UBE2D3、FLAGUb级联中，加入UbCMK后UBE2D3～Ub带减弱、游离FLAGUb积累，FLAGUbCMK直接与UBE1成更高分子量物种，表明CMK也可共价失活E1活性位点半胱氨酸。
FLAGUbCMK as a Probe to Quantify Active E2 Enzymes in Different Stress Conditions部分，二酰胺氧化应激增强UBE2M捕获，micafungin可阻断；MG132蛋白毒应激增强UBE2N；poly(I:C)炎症增强UBE2L3，NSC-697923阻断；2-脱氧-D-葡萄糖代谢应激与依托泊苷基因毒应激增强UBE2D3；过氧化亚硝基氧化LDL脂质氧化应激增强UBE2D2；N-乙基马来酰亚胺（NEM）预处理消除UBE2D2/D3标记，说明捕获依赖可及催化半胱氨酸。
讨论与结论部分，研究人员指出已有Ub探针多服务DUB，UbDHA须E1激活且覆盖不全；FLAGUbCMK凭借高亲电CMK弹头，不需E1预激活即可广泛、稳定、不可逆标记E2，并兼捕E1与半胱氨酸DUB，和UbPA反应谱互补。结论可译为：综上，研究人员建立UbCMK这一独立活动态探针，密度泛函理论计算表明CMK对弱亲核硫醇盐具有低反应能垒；UbCMK经ACPL合成后可广谱富集E2与半胱氨酸DUB，在HEK293T裂解液中把ABPP覆盖扩至以往难以分析的E2亚群，并可在氧化、蛋白毒、炎症、代谢、脂质氧化与基因毒应激下活动依赖地量化内源E2动员；该探针还 engagements E1与DUB，证明UbCMK是拓展UPS中活动态蛋白质分析覆盖、解析生理与病理条件下E2功能的有力化学工具。
