GLP-1R激动剂艾塞那肽-4的双氰钴啉酰胺偶联物在不加重厌食和体重丢失的情况下改善荷瘤大鼠的葡萄糖稳态

《Molecular Pharmaceutics》：A Dicyanocobinamide Conjugate of the GLP-1R Agonist Exendin-4 Improves Glucose Homeostasis in Tumor-Bearing Rats without Exacerbating Anorexia and Weight Loss

　　

癌症厌食-恶病质综合征（cancer anorexia?cachexia syndrome, CACS）是恶性肿瘤常见且导致衰弱的并发症，其特征为食物摄入减少、骨骼肌质量丢失和严重代谢功能障碍。胰岛素抵抗和葡萄糖耐量受损是CACS的突出特征，并导致预后恶化，然而在不加重厌食的情况下改善代谢调控的治疗选择十分有限。尽管胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1R）激动剂能有效改善血糖控制，但其中枢介导的厌食和厌恶效应限制了其在癌症患者中的应用。为解决这一局限，研究人员通过将艾塞那肽-4（exendin-4, Ex4）与双氰钴啉酰胺（dicyanocobinamide, Cbi）偶联开发了一种外周限制性GLP-1R激动剂。Cbi是一种来源于维生素B₁₂的咔啉环，其血脑屏障穿透能力极低。研究人员在体外及健康和荷瘤啮齿动物模型中评估了Cbi-Ex4的作用。Cbi-Ex4保留了GLP-1R激动活性并改善了葡萄糖耐量，且与天然Ex4不同，它不会诱发厌食、体重丢失或不适。这些发现支持外周化GLP-1R激动作用作为一种在癌症中改善代谢功能障碍而不加重不适和恶病质的策略具有前景。

**Cbi-Ex4：一种外周限制性GLP-1R激动剂在肿瘤相关代谢紊乱中的治疗潜力**

**一、研究背景与科学问题**

癌症厌食-恶病质综合征（cancer anorexia?cachexia syndrome, CACS）是恶性肿瘤最常见且最具破坏性的并发症之一，影响高达80%的癌症患者，并约占癌症相关死亡率的20%。该综合征以食物摄入减少、骨骼肌进行性丢失和严重代谢紊乱为核心特征，显著降低患者生活质量并损害抗肿瘤治疗的耐受性和响应性。尽管营养支持是CACS管理的基础手段，但单纯营养补充无法逆转体重丢失或恢复瘦体重，提示该综合征的发病机制远不止热量摄入不足，而是涉及肿瘤诱导的宿主代谢全面重塑，包括能量消耗增加、蛋白分解增强以及底物利用紊乱。

在CACS众多的代谢异常中，胰岛素抵抗和葡萄糖耐量受损尤为突出。事实上，糖稳态紊乱是癌症最早被记录到的代谢改变，也是恶性肿瘤最早被认识的全身性表现之一，甚至早于现代影像诊断技术的出现。这些糖尿病样表型不仅与预后恶化和治疗响应性降低相关，而且受损的胰岛素信号可能通过促进肌肉消耗和限制合成代谢过程直接推动恶病质进展。然而，尽管临床需求迫切，能够在不加重厌食和体重丢失的前提下恢复代谢稳态的药理学策略仍然极为有限。

胰高血糖素样肽-1受体（glucagon-like peptide-1 receptor, GLP-1R）激动剂是强效的降糖药物，其主要通过激活胰腺β细胞上的GLP-1R发挥葡萄糖调节作用。然而，GLP-1R激动剂在肿瘤学中的应用受到根本性制约——它们能通过激活最后区（area postrema）和孤束核（nucleus of the solitary tract）等后脑关键区域的GLP-1R表达神经元，强效抑制摄食并诱发恶心和呕吐。虽然食欲抑制和体重降低在肥胖症治疗中是理想效果，但在癌症患者中却可能加剧恶病质并恶化临床结局。这一问题对于合并2型糖尿病的癌症患者尤为突出，因为该群体越来越多地使用GLP-1R激动剂，而传统GLP-1R激动剂的厌食和厌恶效应可能进一步加重癌症相关的体重丢失。因此，核心治疗挑战在于保留GLP-1R激活的代谢获益，同时限制其进入驱动厌食和不适的中枢神经环路。

**二、研究策略与核心发现**

为应对上述挑战，研究人员采用了一种创新策略——将Ex4与双氰钴啉酰胺（dicyanocobinamide, Cbi）共价偶联，构建外周限制性GLP-1R激动剂Cbi-Ex4。Cbi是维生素B₁₂的前体咔啉环衍生物，具有高极性和极低的被动扩散能力，其进入中枢神经系统需要主动转运机制，而成体脑内该类转运系统基本缺失。这一“咔啉化”（corrination）策略理论上可保留外周GLP-1R信号（包括胰腺水平），同时不干扰内源性维生素B₁₂的生理功能，从而避免对B₁₂依赖通路的脱靶效应。

此前在地鼩（Suncus murinus）——一种具有呕吐能力的GLP-1生理研究物种——中进行的急性概念验证研究表明，Cbi-Ex4在不诱导摄食减少或呕吐的情况下改善葡萄糖耐量，与天然Ex4形成鲜明对比。基于这些发现，本研究旨在系统地评估Cbi-Ex4在啮齿动物模型中的代谢和行为效应，具体包括：（1）评估Cbi-Ex4在GLP-1R上的效力及β-arrestin招募活性；（2）在无病大鼠中评估亚慢性Cbi-Ex4和天然Ex4给药对摄食、体重、葡萄糖耐量和不适的影响；（3）在荷瘤大鼠中比较Cbi-Ex4与Ex4的效应。

**三、主要关键技术方法**

本研究综合运用了多种技术手段。在体外层面，研究人员利用荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer, FRET）实验检测人及大鼠GLP-1R激活后细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）的升高水平，评估化合物的激动效力；同时使用PathHunter GLP-1R eXpress试剂盒通过化学发光检测β-arrestin招募，评估信号偏向性。在体内层面，研究采用Sprague-Dawley大鼠和Buffalo大鼠（后者为Sprague-Dawley衍生的近交系，用于荷瘤实验）。药物经腹腔注射（intraperitoneal, IP）给药，每日两次，持续7天。实验中每日记录摄食量、高岭土摄入（pica，大鼠恶心的成熟替代指标）和体重。葡萄糖耐量评估采用腹腔葡萄糖耐量试验（intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）。肿瘤模型采用Morris-7777肝癌细胞（McA-RH7777, ATCC）皮下接种于Buffalo大鼠肩胛间区诱导肿瘤生长。实验终点称量腓肠肌、胫骨前肌和比目鱼肌重量以评估骨骼肌质量变化，并称量肿瘤质量。

**四、研究结果**

**（一）Cbi-Ex4在大鼠和人GLP-1R上维持与天然Ex4相当的激动活性**

在人GLP-1R FRET实验中，追踪cAMP升高水平，叠氮修饰的Ex4和Cbi-Ex4的EC₅₀值分别为1.885 nM和4.863 nM（Ex4为4.690 nM）。在β-arrestin招募实验中，Ex4和叠氮修饰Ex4的效力相当（EC₅₀分别为8.742 nM和7.718 nM），而Cbi-Ex4的相对效力较Ex4降低3.7倍。在大鼠GLP-1R实验中，Ex4和Cbi-Ex4均表现出强效激动活性，EC₅₀分别为8 pM和22 pM。这些结果表明Cbi-Ex4保留了GLP-1R激动作用，但β-arrestin招募效力有所减弱。

**（二）亚慢性Cbi-Ex4给药在健康大鼠中改善葡萄糖耐量而不诱导摄食减少、体重丢失或不适**

在Sprague-Dawley大鼠（n=12/组）中，每日两次给予Ex4、等摩尔Cbi-Ex4或生理盐水持续7天。Ex4处理在整个治疗期间产生显著且持续的摄食减少和明显体重丢失，而Cbi-Ex4处理的动物摄食量与对照组相当，仅治疗最后两天出现轻微体重下降。Ex4显著增加高岭土摄入，而Cbi-Ex4未诱导高岭土摄入，表明重复给予Cbi-Ex4不会在大鼠中产生不适。重要的是，两种药物在IPGTT中对血糖波动的抑制效果相同，显示Cbi-Ex4在亚慢性给药下保留葡萄糖调节效力。

在Buffalo大鼠（n=6-7/组）中的验证实验得到了一致结果：Ex4产生强效且持续的摄食抑制和体重丢失，Cbi-Ex4则对摄食和体重均无显著影响；Ex4增加高岭土摄入而Cbi-Ex4没有；两种药物均显著降低IPGTT中20分钟时间点的血糖水平。值得注意的是，Ex4在Buffalo大鼠中的降糖效果较Sprague-Dawley大鼠弱且短暂，而Cbi-Ex4产生了更持续的糖耐量改善。

**（三）亚慢性Cbi-Ex4给药在荷瘤Buffalo大鼠中改善葡萄糖耐量而不加重厌食、体重丢失或肿瘤进展**

在接种Morris-7777肝癌细胞11天、出现厌食反应后，荷瘤Buffalo大鼠（n=6-7/组）接受Ex4、等摩尔Cbi-Ex4或生理盐水每日两次治疗，持续7天。Ex4治疗诱导了明显的摄食减少，尤其在治疗初期，导致整个治疗期间平均摄食量显著降低，并伴随明显的体重丢失。相比之下，Cbi-Ex4治疗对荷瘤动物的摄食量和体重均无显著影响。关键的发现是，Cbi-Ex4显著改善了IPGTT期间的葡萄糖耐量，而Ex4在此条件下未产生显著的降糖效果。实验终点时，各组间腓肠肌、胫骨前肌和比目鱼肌重量无显著差异，表明两种药物均未加重或缓解肿瘤相关的肌肉消耗。肿瘤质量在组间也无差异，说明两种化合物均未影响肿瘤生长。

**五、讨论与结论**

本研究通过系统的体外和体内实验证明，将Ex4与Cbi偶联形成的Cbi-Ex4能够在保留GLP-1R介导的葡萄糖调节功效的同时，消除其摄食抑制、体重降低和不适诱导等中枢介导的不良效应。这一效应在两种大鼠品系中一致，并在表现出CACS样代谢紊乱的荷瘤动物中得以保持。研究结果支持了GLP-1R激动剂的摄食抑制和厌恶效应主要由中枢受体参与驱动，而其葡萄糖调节功能可通过外周通路维持的概念。

机制上，咔啉化修饰显著改变了Ex4的理化性质，增加极性从而限制被动组织穿透和对中枢GLP-1R群体的功能性激活。此前使用荧光标记的咔啉化Ex4和天然Ex4的研究显示，咔啉化Ex4在中枢神经系统中的存在较天然Ex4减少，包括在最后区/孤束核这一介导GLP-1R相关厌食和不适的关键后脑区域。此外，Cbi-Ex4在体外表现出β-arrestin招募效力降低约3.7倍，提示信号偏向性也可能部分参与其改善的耐受性。Cbi-Ex4改善葡萄糖耐量的外周机制可能包括增强葡萄糖刺激的胰岛素分泌和/或抑制胰高血糖素分泌，但研究未动态测量胰岛素和胰高血糖素水平。Cbi-Ex4在Buffalo大鼠中比天然Ex4更一致地改善糖耐量，可能与限制中枢GLP-1R依赖的交感输出增加和短暂高血糖效应有关，但交感活性等参数未被直接测量。

荷瘤动物中天然Ex4未显著改善糖耐量，而Cbi-Ex4有效，提示肿瘤状态下可能存在对GLP-1R介导厌食的敏感性增加，以及中枢GLP-1R激活对血糖调节的干扰。两种化合物对骨骼肌重量和肿瘤质量均无影响，但较短的疗程和终点法评估限制了对其长期效应的判定。肿瘤质量无组间差异提示两种化合物在该条件下均未影响肿瘤生长，但研究设计主要以行为学和代谢的概念验证为目的，未针对肿瘤进展进行充分效力评估。

综上所述，本研究支持将肠促胰岛素疗法的外周与中枢作用相分离的理念，这可能推动开发适用于食欲抑制和不适加重特别不受欢迎的临床场景的GLP-1R激动剂。外周化GLP-1R激动剂如Cbi-Ex4，可能代表一种在包括癌症在内的恶病质疾病状态下改善葡萄糖稳态同时避免传统GLP-1疗法相关不良摄食效应的有前景策略。该研究发表在《Molecular Pharmaceutics》。