《Frontiers in Public Health》：High fidelity wastewater surveillance as an early warning tool for diphtheria in the German Ruhr metropolitan area
编辑推荐：
引言：白喉是由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)及相关物种的产毒菌株引起的、在欧洲重新出现的疫苗可预防疾病。在长期开展疫苗接种计划的地区，白喉常被视为过去的疾病，因此并不常规检测，可能导致低水平传播被低估和延迟识别。除C.
引言：白喉是由白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)及相关物种的产毒菌株引起的、在欧洲重新出现的疫苗可预防疾病。在长期开展疫苗接种计划的地区，白喉常被视为过去的疾病，因此并不常规检测，可能导致低水平传播被低估和延迟识别。除C. diphtheriae外，Corynebacterium ulcerans、Corynebacterium pseudotuberculosis、Corynebacterium rouxii、Corynebacterium ramonii等也可携带白喉毒素基因(tox)，非产毒但携带tox基因(NTTB)的菌株也存在风险。tox基因内点突变增加及携带tox的棒状杆菌多样性上升，给诊断、分子监测和风险评估带来挑战。德国柏林和法兰克福的暴发显示，即便在高免疫人群中仍可形成聚集性病例并出现死亡。
方法：研究人员开发了一种高保真基于废水(wastewater-based epidemiology, WBE)的监测方法，用于检测tox基因，以作为临床和实验室监测的补充早期预警系统。
结果与讨论：在常规宏基因组监测中，包括对本地污水处理厂每周监测，使用tox特异性隐马尔可夫模型(Hidden Markov Model, HMM)在160份环境样本中的18份检测到tox信号。受技术和样本可得性限制，15份HMM阳性样本进行了PCR确认，其中14份扩增产物经扩增子测序确认。一次检测在时空上与一例tox阳性棒状杆菌临床病例吻合：该周医院病区废水和下游污水处理厂均为阳性，次周转阴。其余废水信号未发现对应临床分离株。尽管不能下结论，但这种一致性支持在废水中检出tox时向临床医生和公共卫生部门发出警报。
研究背景方面，白喉是由产毒棒状杆菌(Corynebacterium spp.)引起的疫苗可预防疾病，近年来在欧洲重新出现，柏林和法兰克福等地已发生聚集性病例并出现死亡。高疫苗接种覆盖率地区因临床警惕性下降、常规检测不足，可能使产毒菌株低水平传播被忽视，形成沉默传播风险。除经典白喉棒状杆菌外，C. ulcerans、C. pseudotuberculosis、C. rouxii、C. ramonii等均可携带白喉毒素基因(tox)，非产毒但携tox基因(NTTB)菌株也具有潜在危险。tox基因由棒状杆菌噬菌体通过重组整合入染色体，位置不固定，且群体中tox点突变积累，使传统组装型宏基因组分析难度加大。基于废水流行病学(WBE)可在不依赖就医行为情况下捕获人群水平病原体循环信号，因此有必要探索其在白喉早期预警中的可行性。
该研究由研究人员发表于《Frontiers in Public Health》。研究人员开展了一项将无偏宏基因组筛查与靶向分子验证结合的研究，旨在评估利用废水监测产毒棒状杆菌和tox基因作为白喉早期预警工具的可行性，并借助RNA聚合酶β亚基(rpoB)基因推断可能宿主物种。
主要关键技术方法方面，研究人员于2022年11月至2024年8月收集德国鲁尔都市圈160份废水样本，包括约139万人口服务范围的Kl?ranlage Emscher Mündung(KLEM)厂进水、市政污水系统点位、埃森大学医院病区污水，以及北部独立污水处理厂样本；采用24小时混合样或瞬时样。随后进行DNA提取、鸟枪法宏基因组测序，先用fastp质控和minimap2去除人源序列，MEGAHIT组装，Prodigal预测开放阅读框，再用PFAM的PF02764、PF01324、PF02763三个tox相关蛋白家族HMM以hmmsearch筛选；对阳性样本用多对tox引物和WHO推荐的rpoB引物做PCR，扩增产物经Oxford Nanopore测序并用BLASTx比对；另用DIAMOND超敏感模式对自定义128条棒状杆菌rpoB蛋白库做物种谱系普查，并以热图展示，但不证明rpoB与tox在同一contig上物理连锁。
研究结果部分，Detection of diphtheria tox gene in wastewater metagenomes：研究人员用tox结构域HMM筛查160份废水宏基因组，18份阳性，最大bitscore为25至81，且全部仅命中PF01324即tox的R结构域；PCR中仅C结构域引物PP3可稳定扩增，说明C域更不易受遗传变异影响。15份可做PCR确认的样本中多数为阳，17份HMM阴性对照均无目标条带，14份扩增子测序与NCBI nr库tox区域匹配。rpoB PCR显示9份为C. pseudotuberculosis或C. ulcerans，8份排除C. diphtheriae、C. pseudotuberculosis和C. ulcerans，无样本归为C. diphtheriae。
Possible tox gene hosts identified in wastewater samples：研究人员对所有含rpoB的contig做聚类，得到三群，集群1为人和宿主相关棒状杆菌并含已知tox宿主，集群2为环境、土壤、乳品、皮肤共生菌，集群3为水生、动物共生及机会致病菌。医院废水样品相互更相似且集群1丰度更高，但多数tox阳性样本宿主未能由rpoB PCR确定，提示可能存在比临床常规靶标更广的tox相关棒状杆菌谱。
Patient-derived samples matching wastewater-based findings：2024年埃森大学医院一例tox阳性C. ulcerans病例确诊后3天，其病区废水tox阳性且排除C. diphtheriae，同期该厂服务百万人口的进水也检出tox，下周两份样本均转阴，说明临床病例与医院及市政废水tox信号存在时间关联，体现废水监测可提供近实时循环信号，但不能据此确立因果或预测性能。
讨论部分总结中，研究人员指出该方法经PCR、扩增子测序和临床记录交叉验证，具备纳入持续监测体系的潜力，但尚不能给出正式灵敏度、特异度和预测值。tox基因检测本身不能证明细菌宿主或毒素表达，也不能等同于粪便排毒，可能来自呼吸道分泌物、创面冲洗或医院废水等。HMM适合发现片段化、低丰度、变异同源序列，本研究是纵向废水监测tox基因的早期概念验证而非成熟例行检测。抓样与24小时混合样并存也限制跨样本定量比较。研究意义在于把tox基因及其潜在宿主纳入WBE框架，用无偏宏基因组加靶向验证补足临床和实验室监测，在白喉重新出现背景下可提升人群水平早期预警和公共卫生准备能力。
研究结论部分译为：在这项工作中，研究人员开发并应用了一种可在废水宏基因组样本中识别白喉tox基因的方法。该方法通过体外PCR、扩增子测序及与临床病例记录比对得到验证，凸显其整合进现有监测体系的潜在稳健性。技术与样本可得性限制使18份HMM阳性中的15份完成PCR确认，14份扩增子获序列确认；17份HMM阴性对照均无PCR阳性。一次废水检测可由同期临床病例合理解释，其余信号无匹配临床分离株。这些结果支持其监测功能，但未确立正式的灵敏度、特异度或预测性能。该方法有机会追踪tox基因在棒状杆菌属内甚至跨属的潜在移动，这对水平基因转移及非典型宿主出现产毒性具有相关性，但其临床意义未知。仅检出tox基因不能确立细菌宿主或证明毒素表达。基于序列的工作流具适应性：若遗传改变削弱现有引物，宏基因组数据可指导引物重设计。研究人员发现仅靶向tox C区的引物可重复扩增，提示部分现行引物可靠性有限。C. diphtheriae主要在呼吸道和皮肤标本中查找，粪便检测非常规，因此废水tox信号不能假定为粪便脱落。仍待解决问题包括低丰度靶标阈值优化、与临床流行病学持续交叉验证、抓样与混合样导致的定量不可比。鉴于欧洲白喉复现，研究人员支持把tox基因及其潜在宿主物种纳入WBE框架；HMM筛查可在已做深度鸟枪宏基因组时增量添加，确认tox信号后应启动靶向临床与公共卫生评估。PCR验证表明公共卫生部门也可用常规tox基因PCR先行预警，但单独PCR不能提供序列和分类来源。
