内质网应激和高尔基体相关特征揭示肺腺癌中免疫微环境重塑及MUC16驱动的PI3K/AKT激活

《Frontiers in Immunology》：An endoplasmic reticulum stress- and Golgi apparatus-related signature reveals immune microenvironment remodeling and MUC16-driven PI3K/AKT activation in lung adenocarcinoma

　　

摘要
背景：肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）最常见的组织学亚型，具有显著的临床异质性，并常出现对靶向治疗的获得性耐药。越来越多的证据表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ER stress）和高尔基体功能障碍在重塑肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中发挥关键作用，然而它们对LUAD进展的协同贡献仍知之甚少。在此背景下，研究人员构建了一个基于机器学习的内质网应激和高尔基体相关基因（endoplasmic reticulum stress- and Golgi apparatus-related genes, EGRGs）预后框架，以改善LUAD的预后分层并探索其潜在治疗意义。
方法：从TCGA和GEO收集LUAD患者的公开转录组谱及相应临床数据。将TCGA-LUAD队列中鉴定的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）与EGRGs取交集，获得LUAD中差异表达的EGRGs。在TCGA-LUAD队列中构建基于机器学习的预后特征，并在外部GEO数据集中验证。根据计算出的风险评分对患者进行分层，随后比较不同风险组的肿瘤突变负荷、免疫微环境特征和药物敏感性。此外，通过体外实验进一步评估关键基因MUC16。
结果：基于133个差异表达的内质网应激和高尔基体相关基因，建立了17基因预后特征。该特征的预后性能在额外的独立LUAD队列中得到进一步验证，所定义的风险组在肿瘤微环境特征、免疫浸润模式、突变景观和预测治疗反应方面存在显著差异。后续生物信息学分析和体外验证表明，MUC16是LUAD中显著上调的基因，其高表达与较差的患者预后相关。功能学和机制学实验进一步提示，MUC16可能至少部分通过FAK介导的PI3K/AKT信号激活促进LUAD细胞的恶性表型。
结论：研究人员开发了基于EGRG的LUAD预后特征，可能为风险分层和治疗决策提供有价值的参考。进一步的证据表明，MUC16可能至少部分通过FAK介导的PI3K/AKT信号激活促进LUAD进展，支持其作为预后生物标志物及进一步治疗研究候选靶点的潜在价值。

论文解读

肺癌在2022年约占全球新发病例250万例、死亡180万例，疾病负担沉重。肺腺癌（LUAD）是非小细胞肺癌（NSCLC）的重要亚型，临床异质性明显，靶向治疗和免疫治疗虽拓展了治疗选择，但不同治疗反应和获得性耐药仍限制长期疗效。内质网（endoplasmic reticulum, ER）与高尔基体（Golgi apparatus）是蛋白质加工和运输的关键细胞器：ER负责蛋白质折叠与翻译后修饰，高尔基体参与糖基化、分选和包装，二者功能紧密偶联。ER应激与高尔基体功能障碍可重塑肿瘤微环境（TME），但二者在LUAD中的协同作用尚不明确。既往研究多单独基于ER应激或高尔基体相关基因构建预后模型，未能全面反映两者的相互影响。为此，研究人员整合内质网应激和高尔基体相关基因（EGRGs），开发了基于机器学习的LUAD预后特征，以优化风险分层；并进一步结合体外实验探索关键基因MUC16的功能和机制。该研究为LUAD的风险评估、免疫微环境解析及潜在靶点提供了新依据，论文发表在《Frontiers in Immunology》。

研究人员从TCGA-LUAD队列及GEO（GSE72094、GSE30219、GSE26939、GSE31210、GSE126044）收集转录组和临床数据。利用limma筛选差异表达基因，并与MSigDB中的内质网应激和高尔基体相关基因取交集。采用单变量Cox和101种机器学习组合构建预后模型，以平均C-index最高选定随机生存森林（Random Survival Forest, RSF），并经最小深度法筛选17个基因。通过Kaplan-Meier、ROC、Cox回归及列线图评估模型。免疫浸润分析使用ESTIMATE、CIBERSORT、TIMER、MCP-counter、EPIC，TIDE评估免疫逃逸，maftools分析突变，oncoPredict预测药物敏感性。体外实验中，在PC9和H1975细胞系中敲降或过表达MUC16，并采用CCK-8、EdU、Transwell、流式凋亡分析、Western blot、免疫荧光及免疫共沉淀验证功能与机制。

3.1 LUAD中EGR-DEGs的功能图谱：通过差异表达和交集分析得到133个EGR-DEGs，GO分析显示富集于糖蛋白代谢过程、高尔基体腔、糖基转移酶活性；KEGG显著富集于粘蛋白型O-聚糖生物合成通路；GSEA显示核糖体生物发生、rRNA加工等通路激活，而细胞黏附、内吞等通路受抑制。

3.2 预后模型的构建：133个EGR-DEGs中41个与生存相关；基于这些候选基因构建101个模型，RSF模型平均C-index最高（0.774），经最小深度筛选保留17个基因，并展示基因重要性和表达谱。

3.3 预后特征的验证：按中位风险评分分层，TCGA-LUAD队列中高风险组OS和PFS显著较差，1/3/5年ROC AUC分别为0.96、0.99、0.97；外部队列GSE72094和GSE30219以及额外验证队列GSE26939和GSE31210均证实风险分层能力。

3.4 列线图性能和验证：单因素和多因素Cox回归显示风险评分是独立预后因素；构建的列线图校准曲线良好，AUC均>0.9，能有效区分不同生存结局的患者。

3.5 肿瘤微环境内的免疫特征：高风险组CD8⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞和髓样树突状细胞浸润减少，基质/免疫/ESTIMATE评分降低，TIDE评分升高，免疫检查点CD276表达升高，干性特征增强；在抗PD-1治疗队列GSE126044中，非缓解者RSF预测风险评分有高于缓解者的趋势（P=0.141）。

3.6 跨风险组的体细胞突变特征和TMB：高风险组肿瘤突变负荷（tumor mutational burden, TMB）更高，风险评分与TMB正相关；低风险且高TMB的患者总生存最佳；两组主要突变基因相似，但高风险组整体突变负荷更高。

3.7 预测治疗反应：预测IC₅₀分析显示，高风险组对多西他赛、紫杉醇、BI-2536、AZD6738、MK-1775和拉帕替尼的预测IC₅₀更低，提示这些药物在高风险组中可能更有效。

3.8 MUC16及其在LUAD中的预后意义：蛋白-蛋白相互作用网络显示CFTR、SLC2A1、MUC16是核心节点；综合网络中心性、预后相关性及与ER/高尔基体依赖性糖蛋白加工的关联，优先选择MUC16。免疫组化和TCGA数据显示MUC16在LUAD中高表达，且与不良预后相关；PC9和H1975细胞中MUC16蛋白水平显著高于正常支气管上皮细胞BEAS-2B，并成功建立敲降和过表达模型。

3.9 MUC16促进肺腺癌细胞恶性表型：敲降MUC16显著抑制PC9和H1975细胞增殖（CCK-8降低、EdU阳性比例降低），促进凋亡，减弱迁移和侵袭；过表达MUC16则增强增殖和DNA合成能力。

3.10 MUC16激活LUAD细胞中的PI3K/AKT信号：单基因GSEA显示高MUC16表达富集于PI3K/AKT相关通路；Western blot证实敲降MUC16降低p-PI3K和p-AKT水平，过表达则相反；PI3K抑制剂Buparlisib可逆转MUC16过表达诱导的PI3K/AKT激活，并部分消除其对增殖、迁移和侵袭的增强作用。

3.11 FAK介导MUC16诱导的PI3K/AKT激活：免疫共沉淀显示MUC16与FAK存在于同一复合物，免疫荧光显示二者共定位；敲降MUC16降低FAK磷酸化，过表达则增加；FAK抑制剂defactinib抑制MUC16诱导的FAK磷酸化，并伴随PI3K和AKT磷酸化降低，同时部分逆转MUC16增强的迁移和侵袭。

讨论部分指出，该17基因预后特征在多个队列中均有效，风险分层与免疫抑制性微环境相关，提示ER应激和高尔基体功能障碍可能通过重塑TME促进免疫逃逸。MUC16作为最大的膜结合粘蛋白，其成熟高度依赖ER和高尔基体稳态；本研究发现MUC16在LUAD中显著上调，并通过FAK介导的PI3K/AKT信号促进恶性表型，与既往在胰腺癌中的证据一致。研究局限性包括需更大临床队列验证、免疫特征主要依赖计算推断、以及需更多体内实验确认FAK的介导作用。
研究结论：研究人员建立并验证了一个与EGRG相关的LUAD预后特征，具有良好的预测性能，并确定MUC16是一个可能促进LUAD进展的关键基因。功能学和机制学实验提示，MUC16可能至少部分通过FAK介导的PI3K/AKT信号激活促进LUAD细胞的恶性表型。这些结果为LUAD的风险分层、预后评估和潜在治疗靶点的探索提供了新的见解。