《Virulence》：Functional characterization of SHC-like triterpene cyclase genes in azole response and virulence-related traits of Aspergillus fumigatus
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烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种重要的机会性真菌病原体，不断增加的唑类耐药性对曲霉病的治疗构成了挑战。角鲨烯（squalene）是麦角固醇生物合成的上游前体，也可能被SHC样三萜环化酶（SHC-like triterpene cycl
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种重要的机会性真菌病原体，不断增加的唑类耐药性对曲霉病的治疗构成了挑战。角鲨烯（squalene）是麦角固醇生物合成的上游前体，也可能被SHC样三萜环化酶（SHC-like triterpene cyclase）利用，提示角鲨烯相关代谢、膜适应和唑类反应之间可能存在关联。然而，SHC样三萜环化酶基因在烟曲霉中的作用仍不清楚。本研究利用比较生物信息学分析、基因缺失、表型测定、唑类药敏试验、转录组学和宿主互作模型，对三个候选基因shc1、shc2和shc3进行了功能表征。序列、基因组背景、系统发育和结构分析表明这三个候选基因之间存在差异。单个shc基因缺失对营养生长影响有限，而shc1缺失则轻度降低了对伏立康唑（voriconazole）和泊沙康唑（posaconazole）的敏感性，表现为MIC值升高2倍和抑制率降低。转录组分析揭示了不同的重塑模式，其中Δshc3显示出最广泛的转录变化，尽管未检测到MIC改变。靶向代谢物谱分析和PI摄取分析进一步支持shc缺失、固醇/藿烷型三萜平衡和膜相关特性之间的关联。shc缺失还改变了上皮细胞互作表型，而Δshc1在大蜡螟（Galleria mellonella）中显示出降低的致死性。在临床分离株中，shc转录水平升高与唑类耐药背景相关。这些发现表明SHC样三萜环化酶基因之间存在功能分化，并提示shc1可能参与烟曲霉的唑类相关适应和毒力相关性状。
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是重要的机会性致病真菌，唑类耐药性的上升给侵袭性曲霉病治疗带来挑战。角鲨烯是麦角固醇生物合成的上游前体，也可被SHC样三萜环化酶（SHC-like triterpene cyclase）利用，提示其可能参与膜适应与唑类反应。然而，烟曲霉中该类酶基因的功能尚不清楚。研究人员基于前期发现磷脂酶sac1缺失株中SHC编码基因表达显著下调的线索，系统研究了shc1、shc2和shc3三个候选基因，旨在阐明它们在唑类耐药、代谢适应和毒力相关性状中的作用。该研究发表在《Virulence》上，为理解非cyp51A介导的唑类适应机制提供了新视角。
研究人员主要运用了比较生物信息学分析（BLASTp、antiSMASH、系统发育、AlphaFold3结构预测）、基因缺失突变体构建与表型测定、EUCAST微量稀释法药敏试验、转录组测序（RNA-seq）及RT-qPCR验证、靶向气相色谱-质谱联用（GC-MS）代谢物定量、碘化丙啶（PI）摄取实验、A549肺泡上皮细胞互作模型和蜡螟（Galleria mellonella）感染模型等方法。临床分离株来源包括6株唑类耐药和6株唑类敏感烟曲霉临床分离株。
### 结果
**1. SHC样三萜环化酶基因的鉴定与比较分析**
研究人员以嗜酸热脂环芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）的角鲨烯-藿烯环化酶为查询序列，通过BLASTp在烟曲霉Af293蛋白组中鉴定出三个候选基因shc1、shc2、shc3。antiSMASH分析显示shc1位于与fumihopaside样生物合成基因簇相似的萜烯区域，而shc2和shc3共同位于7号染色体另一萜烯区域。系统发育和结构预测显示三个候选基因在序列、基因组背景和催化结构上存在差异，shc2与shc3更相近，shc3的催化区差异更大。
**2. 单个shc基因缺失对营养生长和发育影响有限**
在CEA17Δku80背景菌株中分别敲除shc1、shc2、shc3，经诊断PCR和RT-qPCR验证。在AMM固体培养基上，缺失株未表现出严重生长缺陷；Δshc2在28°C和37°C下菌落直径轻度增加，Δshc3在48°C下轻度减小。在RPMI-1640液体培养基中生长曲线无明显差异。Δshc1和Δshc3产孢量增加；透射电镜未见明显形态异常。表明单个shc基因缺失仅引起条件依赖性且有限的变化。
**3. shc1缺失轻度降低烟曲霉对唑类的敏感性**
在含唑类药物的AMM平板上，Δshc1对伏立康唑和泊沙康唑表现出轻度生长优势。EUCAST法检测发现Δshc1对伏立康唑和泊沙康唑的MIC值较亲本株升高2倍，而Δshc2和Δshc3无变化。在亚抑制浓度（0.25 μg/mL伏立康唑、0.125 μg/mL泊沙康唑）下，Δshc1的抑制率低于其他菌株。亲本株中shc1表达受三种唑类药物诱导。靶向GC-MS显示Δshc1中藿烷-3β,22-二醇减少、麦角固醇轻度增加；PI摄取实验显示膜通透性变化。这些结果支持shc1通过影响固醇/藿烷型三萜平衡和膜相关特性参与唑类反应。
**4. 单个shc基因缺失诱导不同的转录组重塑模式**
RNA-seq分析显示三个缺失株与亲本株转录谱分离明显；Δshc3差异表达基因数量最多，Δshc1和Δshc2较少。KEGG富集显示Δshc1和Δshc2差异基因主要富集于代谢和蛋白质合成通路，Δshc3则富集于次级代谢和代谢重编程通路。尽管Δshc3中cyp51A、atrR、mdr1等唑类反应相关基因表达升高，但未引起MIC改变，说明转录水平升高不足以决定表型。
**5. 单个shc基因缺失对上皮细胞相互作用和全宿主毒力产生不同影响**
在A549上皮细胞模型中，Δshc1和Δshc3黏附率增加，三个缺失株的内化真菌回收量均增加。但在蜡螟感染模型中，仅Δshc1感染组幼虫存活时间显著延长，即致死性降低；Δshc2和Δshc3与亲本株无显著差异。表明体外黏附/内化增强并不等同于整体毒力增强。
**6. 临床分离株中shc转录水平升高与唑类耐药背景相关**
对12株临床分离株（6株耐药、6株敏感）的RT-qPCR分析显示，耐药组中shc1、shc2、shc3的转录水平整体高于敏感组，且组内变异更大。提示shc表达与唑类耐药临床背景存在关联，但不能证明其独立驱动临床耐药。
### 讨论与结论
讨论指出，三个SHC样三萜环化酶基因存在功能分化，并非简单冗余。Δshc1虽转录组变化有限，却表现出最明显的唑类敏感性改变和特异的代谢物模式；Δshc3转录组变化广泛但无MIC变化，可能反映代偿性转录重塑。靶向GC-MS和PI数据支持shc1通过膜相关代谢适应影响唑类反应，但角鲨烯水平、完整三萜产物谱和膜流动性等未测定，机制仍需验证。A549模型与蜡螟模型结果不一致，提示不同感染阶段和宿主因素的差异。临床分离株关联提示shc表达或可作为耐药背景的辅助指标。总之，shc1可能通过调节固醇/藿烷型三萜平衡和膜特性，参与烟曲霉的唑类适应和毒力相关性状；shc2与shc3的功能有待进一步研究。
