牛奶来源的蛋白胨通过抑制III型分泌系统降低EHEC毒力

《Virulence》：Milk-derived peptone reduces EHEC virulence by inhibiting the type III secretion system

　　

饮食与人类整体健康之间的联系已得到充分证实，某些饮食已知能促进健康并降低患慢性病的风险。既往研究也已证明饮食对微生物群组成、多样性和适应性有直接影响，进而可改变针对肠道病原体的定植抵抗力和免疫应答。然而，关于饮食对病原菌毒力的直接影响，目前所知甚少。为在保持常量营养素组成不变的情况下研究饮食对细菌毒力的影响，研究人员使用了来自不同来源（植物源和动物源）的蛋白胨来模拟不同的膳食蛋白质来源。研究人员检测了这些蛋白胨对肠出血性大肠杆菌（EHEC）毒力的影响。结果发现，在由酪蛋白（牛奶的主要蛋白质成分）衍生的蛋白胨中生长的细菌，其三型分泌系统（T3SS）活性显著降低。这一效应表现为细菌对宿主细胞的黏附显著减少，以及T3SS效应因子Tir的转运活性受限。此外，研究还发现牛奶来源的蛋白胨使细菌行为从高毒力、黏附状态转变为更具运动性的状态。最后，研究人员观察到牛奶来源的蛋白胨的抑制作用不仅限于EHEC，还扩展至其他具有T3SS的病原体。虽然酪蛋白中具体的抑制成分仍有待鉴定，但研究结果为开发基于酪蛋白的非抗生素疗法以对抗细菌性腹泻病原体奠定了基础。

论文解读：牛奶来源蛋白胨通过抑制III型分泌系统降低EHEC毒力

饮食与人体健康的关系早已被充分证实，饮食不仅能提供必需的营养素，还可通过调节肠道微生物组影响定植抵抗力和免疫应答，从而影响肠道病原菌感染。然而，既往研究多集中于饮食对微生物组的影响，关于饮食成分是否直接改变病原菌毒力，所知仍然有限。已有少数研究发现特定饮食因素可影响细菌毒力，例如高盐可上调幽门螺杆菌毒力基因、下调霍乱弧菌毒力基因，低聚半乳糖可降低肠出血性大肠杆菌（EHEC）的黏附能力，但不同膳食蛋白质来源对EHEC等肠道病原菌的直接毒力调控作用仍缺乏系统研究。EHEC是一种重要的食源性病原菌，可引起血性腹泻和溶血性尿毒综合征（HUS），其致病关键依赖于由肠细胞脱落位点（LEE）编码的III型分泌系统（T3SS），该系统如同纳米注射器，可将效应蛋白转运至宿主细胞中，介导细菌紧密黏附并形成肌动蛋白基座。基于此，研究人员在维持常量营养素组成一致的前提下，利用来源于牛奶（酪蛋白）、肉、豌豆和大豆的蛋白胨模拟不同膳食蛋白质来源，系统评估其对EHEC毒力的影响。

该研究发现，仅牛奶来源的蛋白胨可显著抑制EHEC的T3SS活性，降低细菌黏附及效应因子Tir的转位，并促使细菌从高毒力黏附状态转向运动性增强状态；该抑制作用还扩展至其他具有T3SS的肠道病原菌。研究结论为基于酪蛋白的非抗生素抗毒力治疗策略提供了基础。相关论文发表在《Virulence》。

关键技术方法方面，研究人员主要运用了以下方法：体外T3S分泌实验（离心分离菌体与培养上清，通过SDS-PAGE和免疫印迹检测T3SS组分的分泌与表达）；以HeLa细胞为宿主的体外感染模型，通过检测JNK剪切和Tir磷酸化修饰评估效应因子转位；细菌黏附实验（感染后裂解细胞涂板计数菌落形成单位CFU）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测毒力相关基因转录；半固体琼脂迁移实验检测细菌运动性；液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析培养基中氨基酸组成；免疫荧光显微镜观察肌动蛋白基座形成。所用菌株包括EHEC EDL933和86-24、EPEC E2348/69、啮齿类柠檬酸杆菌DBS100以及鼠伤寒沙门菌SL1344。

研究结果分为以下几个部分：

第一，牛奶来源的蛋白胨抑制EHEC T3SS活性。研究人员将EHEC在DMEM或含不同来源蛋白胨的培养基中，分别于有氧和厌氧条件下培养，通过T3S实验结合免疫印迹检测分泌型蛋白EspD以及菌体中的Tir和Intimin。结果发现，肉、豌豆和大豆来源的蛋白胨对EspD分泌无明显影响，而牛奶来源的蛋白胨显著降低EspD分泌，并减少Tir和Intimin表达；厌氧条件下该抑制作用依然存在。该效应在另一EHEC临床分离株86-24以及多个不同供应商的牛奶蛋白胨中均可重复。生长曲线显示不同蛋白胨间细菌生长无显著差异，排除生长抑制的干扰。

第二，牛奶来源的蛋白胨在体外减弱EHEC感染能力。研究人员使用HeLa细胞感染模型，通过JNK剪切实验、Tir转位实验和黏附计数评估感染效率。结果发现，培养于牛奶蛋白胨中的EHEC感染HeLa细胞后，JNK剪切水平明显低于DMEM对照，Tir的转位和磷酸化修饰显著减少，细胞相关细菌的CFU也显著下降；而肉、豌豆和大豆来源蛋白胨无此效应。

第三，牛奶来源的蛋白胨改变EHEC基因表达。qRT-PCR结果显示，牛奶蛋白胨显著下调T3SS相关基因ler、espB、espD、tir和eae的转录水平；同时上调鞭毛主调控因子编码基因flhD的转录，而鞭毛组分基因fliC无显著变化。对溶血素基因ehxA和志贺毒素基因stx1的转录无统计学显著影响，但stx2转录水平下降约3.4倍。这表明牛奶蛋白胨并非对所有毒力基因产生一致抑制，而是通过特定调控通路改变细菌毒力表型。

第四，牛奶来源的蛋白胨和酪蛋白水解氨基酸溶液增强EHEC运动性。在含牛奶蛋白胨或酪蛋白氨基酸溶液（casamino acids）的半固体培养基上，EHEC的迁移半径显著大于DMEM对照，提示其运动能力增强；非运动菌株啮齿类柠檬酸杆菌作为阴性对照未见扩散。

第五，赖氨酸和鸟氨酸单独不能介导牛奶蛋白胨的T3SS抑制效应。LC-MS分析显示，牛奶蛋白胨中赖氨酸和鸟氨酸的相对丰度高于肉来源蛋白胨，但将赖氨酸或鸟氨酸单独添加至DMEM并不能抑制EspD分泌，也不改变Tir和Intimin表达，说明这两种氨基酸并非有效成分。

第六，牛奶来源的蛋白胨和酪蛋白氨基酸溶液抑制其他病原菌的T3SS活性。牛奶蛋白胨或酪蛋白氨基酸溶液可显著降低EPEC和啮齿类柠檬酸杆菌的T3SS分泌（EspA、EspB、EspD）及Tir表达；牛奶蛋白胨还可降低鼠伤寒沙门菌SPI-1 T3SS的分泌及效应因子SigD的表达。荧光显微镜观察显示，EPEC在牛奶蛋白胨存在时感染HeLa细胞形成的肌动蛋白基座显著减少，黏附细菌数量明显下降。

讨论部分指出，牛奶蛋白胨下调LEE编码的T3SS基因、上调鞭毛调节基因flhD，这与已知的LEE毒力与鞭毛运动性之间的互斥调控关系一致，提示其作用于上游全局调控通路，使细菌从高毒力黏附状态转向运动性增强状态。该效应并非杀菌作用，而是一种抗毒力效应。酪蛋白来源成分以往多被报道具有抗黏附或抗菌活性，该研究揭示了一种新的抗毒力机制，即通过抑制T3SS而不杀灭细菌来降低致病性。值得注意的是，酪蛋白氨基酸溶液仍能抑制T3SS，提示活性成分为低分子量化合物；但赖氨酸、鸟氨酸及吲哚均不能单独解释该效应，具体活性分子仍有待鉴定。

研究结论部分翻译如下：总之，研究人员报道了牛奶来源的蛋白胨对EHEC及其他肠道病原菌T3SS活性的抑制作用。虽然仍需进一步研究明确具体生物活性成分，但这些发现凸显了基于饮食的非抗生素治疗策略对抗细菌性腹泻感染的潜力。