耶佐病毒（Yezo virus，YEZV）感染的致死性C57BL/6小鼠模型及抗病毒药物疗效评价

《Emerging Microbes & Infections》：Lethal C57BL/6 mouse model for Yezo virus infection and antiviral therapeutic evaluation

　　

耶佐病毒（YeZV）是一种新发蜱传正内罗病毒属（orthonairovirus），可引起人类发热性疾病与肝损伤。其致病机制与有效抗病毒干预手段仍不清楚。研究人员通过将原始毒株在C57BL/6小鼠体内连续传代30次，获得小鼠适应型致死毒株。该适应株可重现人类YEZV感染的关键临床与病理特征，包括白细胞减少（leukopenia）、血小板减少（thrombocytopenia）与肝炎，表现为血清转氨酶升高、肝脏病毒载量高以及坏死性炎症病变。值得注意的是，雌性小鼠死亡率显著高于雄性，揭示疾病易感性的性别相关差异。抗病毒评价显示，法维拉韦（favipiravir）与利巴韦林（ribavirin）均可显著抑制体内YEZV复制、改善存活并降低肝脏病毒负荷。综上，该模型为YEZV致病机制研究与抗病毒药物临床前评价提供了经过严格验证的平台。

研究背景方面，新发蜱传病毒近年成为全球公共卫生关注重点，其中蜱传正内罗病毒属（orthonairovirus）尤为重要。克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）与内罗毕羊病病毒是代表性病原。YEZV于2021年在日本首次报道，后在与中国和俄罗斯蜱叮咬相关病例中检出，人类常表现为急性发热、白细胞减少、血小板减少及肝酶升高。已有动物模型显示，标准近交系小鼠感染无症状，而I型与II型干扰素受体缺陷（AG129）小鼠则均致死；但免疫缺损小鼠无法产生生理相关的抗病毒免疫应答，不适宜研究病毒-宿主互作、致病机制或免疫保护。因此，研究人员通过在免疫健全C57BL/6小鼠中连续传代，旨在建立可反映天然免疫背景的致死模型并评价广谱抗病毒药。

研究人员将YEZV T-HLJ01株在C57BL/6小鼠腹腔接种并连续肝脏传代30代，获得P30高毒力株；以P1与P30感染雌雄小鼠观察生存、体重、组织病毒载量、血常规、生化与肝脾病理；用法维拉韦与利巴韦林经口灌胃治疗雌性小鼠，评估不同起始时间与剂量下的存活、体重及脏器病毒复制；并对P1/P30全基因组比对突变。结论为：P30株在免疫健全小鼠中致致死性感染并具明显肝嗜性，雌鼠更易死亡；法维拉韦与利巴韦林均有效，且法维拉韦在低剂量延迟给药时优于利巴韦林；该模型为YEZV机制与药物临床前研究提供验证平台。论文发表于《Emerging Microbes》。

主要关键技术方法如下：以蜱分离YEZV T-HLJ01株为起点，在3周龄C57BL/6小鼠经腹腔接种并取肝匀浆连续传代至P30；用空斑试验（plaque assay）定量T-HLJ01、P1、P30滴度；以3周龄雌雄C57BL/6小鼠（每组每性别n=6）经腹腔接种1×10²或1×10⁴ PFU，设培养基假感染对照，于3、7、15 dpi取血、咽拭子、肛拭子及脑心肾肝脾肺小肠睾丸等组织；用逆转录定量PCR（RT-qPCR）按标准曲线算病毒RNA拷贝数；全自动血液分析仪与血清生化仪做血常规和肝功；肝脾石蜡切片行苏木精-伊红（H&E）与抗核衣壳（N）蛋白免疫组化（IHC）；雌性小鼠感染后以0、1、3 dpi起每日经口灌胃法维拉韦或利巴韦林100或300 mg/kg共7天；半巢式PCR扩P1/P30全基因组并比对氨基酸突变。样本队列来源为辽宁长生生物提供的C57BL/6小鼠与既往蜱源T-HLJ01分离株。

体内YEZV传代的临床与病毒动力学：研究人员将T-HLJ01在C57BL/6小鼠连续传代，临床征象从P1轻度减重演进至P30濒死；除血与睾丸外，组织滴度随传代上升，肝载量始终最高，说明肝脏是主要复制器官。

P1与P30 YEZV株感染小鼠：P1感染全部存活，仅雌鼠短暂减重；P30感染所有小鼠3 dpi出现竖毛嗜睡，1×10⁴ PFU雌鼠6—7 dpi全死，雄鼠15天存活50%；1×10² PFU时雌鼠33.3%、雄鼠66.7%存活，证明P30毒力增强且雌鼠更易感。

P1与P30感染小鼠的病毒载量：P1在3 dpi血与多数组织可检、肝约10⁶ copies/mg，7 dpi仅肝脾可检，15 dpi全阴，咽肛拭子始终阴；P30在雄鼠3 dpi除脑睾外可检、7 dpi播散全组织，雌鼠3与7 dpi全身高载量且高于雄鼠，15 dpi前雌鼠全死，提示雌鼠病毒复制更旺且无呼吸道/消化道排毒。

P30 YEZV小鼠的组织病理与检验发现：5 dpi雌鼠肝脾肿大、肝发白，肝有多灶炎细胞浸润与肝细胞坏死，脾白髓结构破坏与淋巴耗竭；雄鼠病变轻。血常规示两性别白细胞减少，仅雌鼠血小板减少，仅雄鼠中性粒细胞增多；丙氨酸氨基转移酶（ALT）与天冬氨酸氨基转移酶（AST）均显著升高，总蛋白白蛋白球蛋白下降，印证肝炎与免疫差异。

法维拉韦与利巴韦林抗YEZV效应验证：以雌鼠1×10⁴ PFU腹腔攻击建致死评价模型。300 mg/kg各组0/1/3 dpi起均100%存活；100 mg/kg时0 dpi起均存活，1 dpi起法维拉韦83.3%、利巴韦林83.3%，3 dpi起法维拉韦83.3%、利巴韦林50%，载体对照7 dpi前全死，说明法维拉韦总体占优、足量与早治关键。

抗病毒治疗小鼠的病毒载量：300 mg/kg自0 dpi给药，血与组织病毒数随时间下降且显著低于对照，15 dpi血与多数组织阴，仅少数肝牌低拷；3与7 dpi肝、7 dpi脾中法维拉韦组低于利巴韦林组，显示法维拉韦复制抑制更强。

抗病毒治疗小鼠的组织病理发现：治疗组肝发白减轻，肝炎细胞与坏死较对照明显减少，法维拉韦组仅轻微病变；脾白髓结构基本保存；IHC阳性面积远小于对照，证明两药均减轻器官损伤。

P1与P30株序列变异分析：P30相较P1在核蛋白（Nucleoprotein）有4个氨基酸替换，糖蛋白前体（glycoprotein precursor）15个、RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）15个，其中OTU结构域3个、Bunya_RdRp结构域2个；S/M/L段5′非编码区（5′ UTR）各1核苷酸替换，3′ UTR无变，提示适应突变集中于免疫调控与复制相关区。

讨论部分总结：研究人员指出，YEZV人间多为轻症但常伴肝酶升高，AG129与本研究均证其肝嗜性。雌鼠高死类似CCHFV野生型及Ifnar1^-/-、Rag1^-/-雌鼠趋势，可能源于雌激素与X连锁免疫基因（如Tlr7）驱动的强免疫应答在高滴度适应株下转为免疫病理。连续传代利用RNA病毒高突变与准种（quasispecies）特性筛出高适合度变异株；34个氨基酸替换多位于功能未知区，但OTU域突变可能影响 ubiquitin/ISG15 先天免疫通路，需反向遗传学确认。法维拉韦与利巴韦林在蜱传RNA病毒中广有疗效；本模型中部剂量延迟给药利巴韦林劣于法维拉韦，说明剂量与时机决定疗效，利巴韦林因廉价仍可作资源受限场景备选。

研究结论部分翻译：本研究中，研究人员通过对亲本病毒在C57BL/6小鼠连续30代传代获得致死性YEZV株。利用该适应株，研究人员在C57BL/6小鼠中建立起以显著肝嗜性及雌性个体致病性增强为特征的感染模型，并证明300 mg/kg/天的法维拉韦与利巴韦林均可显著抑制病毒复制并改善临床结局。自YEZV在蜱叮咬患者中被发现以来全球报告超六十例，人类虽多为轻症但血清肝酶常升，提示其肝嗜性，AG129模型与本P30模型一致印证该特性。雌鼠高死亡率虽不能直接外推人男染多而女重症少之流行病学，但属正内罗病毒属模型共性。连续适应依赖RNA病毒高突变率、短周期与准种异质性；P30增强毒力或由34处氨基酸替换驱动，其中OTU域突变可能影响小鼠先天免疫，但因果需反向遗传学验证。法维拉韦与利巴韦林在蜱传RNA病毒中具广谱疗效；本模型中高效量两药不论时机均保护，低剂量3 dpi起利巴韦林存活低于法维拉韦，表明足量与及时给药必要，法维拉韦效优、利巴韦林价廉可作替代。综上，研究人员经30代传代获致死小鼠适应YEZV株，该模型支撑致死感染表征，并确认法维拉韦与利巴韦林体内抗病毒效力，为YEZV致病研究与抗病毒开发提供验证平台与关键数据。