《Frontiers in Oncology》：PPIB and its role in prostate cancer: associations with transcriptomic and splicing alterations
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背景：虽然肽基脯氨酰顺反异构酶B（PPIB）已被认为与肿瘤发生和RNA代谢有关，但其在前列腺癌中的具体功能尚不清楚。方法：研究人员在临床前列腺腺癌样本和TCGA-PRAD队列中评估了PPIB表达。在PC-3细胞中，通过慢病毒shRNA实现稳定的PPIB敲低。随
背景：虽然肽基脯氨酰顺反异构酶B（PPIB）已被认为与肿瘤发生和RNA代谢有关，但其在前列腺癌中的具体功能尚不清楚。方法：研究人员在临床前列腺腺癌样本和TCGA-PRAD队列中评估了PPIB表达。在PC-3细胞中，通过慢病毒shRNA实现稳定的PPIB敲低。随后进行体外实验检测增殖、凋亡、迁移和侵袭，并在裸鼠异种移植模型中评估肿瘤生长。研究人员进行了链特异性RNA测序以鉴定差异表达基因（DEGs）和PPIB相关的可变剪接事件（ASEs），随后进行功能富集分析（GO、KEGG和GSEA）。此外，在PPIB耗竭细胞中重新表达了在sh-PPIB-275靶序列内携带同义替换的shRNA耐药型PPIB cDNA，随后进行Transwell拯救实验。结果：TCGA-PRAD分析显示肿瘤中PPIB mRNA表达显著升高。在配对IHC队列中，探索性ROI水平比较显示肿瘤区域的PPIB H评分高于邻近非肿瘤区域（P < 0.05）。由于同一患者获取了多个ROI，患者水平推断基于ROI平均配对值；肿瘤平均H评分较高，但配对差异无统计学意义。PPIB敲低抑制了细胞增殖、迁移、侵袭和异种移植肿瘤生长。PPIB耗竭后观察到凋亡细胞轻度增加。转录组分析揭示了570个差异表达基因和873个改变的可变剪接事件，富集通路涉及DNA修复、细胞周期和氨基酸代谢。整合DEG和ASE数据鉴定出22个重叠基因，包括代谢调节因子PHGDH和SHMT2。重新表达shRNA耐药型PPIB显著逆转了PPIB敲低引起的迁移和侵袭减少。结论：PPIB促进前列腺癌进展，并与广泛的转录和可变剪接改变相关。这些结果表明PPIB在前列腺癌进展中发挥作用，并为其转录后功能的研究奠定了基础。
研究背景与问题
前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤之一，也是癌症相关死亡的重要来源。已知风险因素包括高龄、非洲裔、DNA修复和易感基因（如BRCA2、BRCA1、ATM、CHEK2、HOXB13）的致病性胚系突变以及前列腺癌家族史。生活方式和环境因素如饮食、肥胖、慢性炎症、代谢紊乱、泌尿生殖道反复感染、内分泌干扰物或电离辐射暴露等也参与发病。前列腺癌的发生是遗传风险、表观遗传重塑和环境暴露共同作用的结果。近年来，异常RNA加工和可变剪接被视为癌症进展的重要特征，并在前列腺癌生物学中受到关注。剪接改变可影响增殖、凋亡、代谢、侵袭和治疗反应相关基因。PPIB属于亲环蛋白家族，其经典功能是肽基脯氨酰顺反异构酶活性，但新近证据提示其可能参与RNA相关调控。然而，在前列腺癌中，PPIB的表达模式、功能作用及其与转录组和剪接变化的关系仍不清楚。因此，研究人员利用临床标本、细胞实验和异种移植模型，并结合转录组分析，系统探究了PPIB在前列腺癌中的作用。
主要技术方法
研究人员从15例配对的前列腺癌和癌旁良性组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本中进行免疫组织化学（IHC）染色，使用QuPath等工具进行数字图像分析并计算H评分；同时分析了TCGA-PRAD队列中的PPIB mRNA表达。在PC-3细胞中，利用慢病毒载体表达靶向PPIB的shRNA（sh-PPIB-275）建立稳定敲低模型，并通过qRT-PCR和Western blot验证敲低效率。随后开展CCK-8增殖实验、Annexin V/PI流式凋亡检测、Transwell迁移和侵袭实验，并在裸鼠皮下接种sh-NC和sh-PPIB-275细胞建立异种移植模型。为明确PPIB下游机制，研究人员进行了链特异性RNA测序（RNA-seq），使用DESeq2和edgeR分析差异表达基因（DEGs），使用ABLas流程鉴定受调控的可变剪接事件（RASEs），并通过GO、KEGG和GSEA进行功能富集。此外，构建了携带同义替换的shRNA耐药型PPIB cDNA并在PPIB敲低细胞中重新表达，进行Transwell拯救实验以验证表型特异性。
研究结果
PPIB在前列腺癌中的表达及PC-3细胞中PPIB敲低的表型效应
IHC染色显示PPIB主要定位于细胞质。探索性ROI水平比较显示肿瘤区域H评分高于癌旁区域（P < 0.05），但该分析未考虑患者内聚类；患者水平配对分析中，肿瘤平均H评分（63.76 ± 11.10）高于配对癌旁组织（52.59 ± 20.79），但差异未达到统计学显著性（配对t检验P = 0.0738）。TCGA-PRAD队列分析显示前列腺癌组织中PPIB mRNA表达显著高于正常对照。在PC-3细胞中敲低PPIB后，qRT-PCR和Western blot确认了转录和蛋白水平的降低。功能实验显示，PPIB敲低显著抑制PC-3细胞增殖、迁移和侵袭能力。流式凋亡检测显示sh-PPIB组凋亡细胞比例较sh-NC组轻度增加，但绝对凋亡率较低，需谨慎解读。额外免疫印迹显示敲低PPIB后cleaved caspase-3升高，cleaved PARP1无显著变化；N-cadherin降低，E-cadherin和Vimentin无显著改变，未构成典型的上皮间质转化（EMT）标志物模式。
shRNA耐药型PPIB重新表达逆转PPIB耗竭细胞的迁移和侵袭缺陷
在sh-PPIB-275细胞中重新表达Flag标记的shRNA耐药型PPIB cDNA后，蛋白质水平得到恢复。Transwell结果显示，与sh-NC + OE-NC组相比，sh-PPIB-275 + OE-NC组迁移细胞数显著减少（Tukey校正P = 0.0193），而重新表达PPIB后迁移能力显著恢复（P = 0.0049），且与对照组无显著差异。侵袭实验同样显示PPIB敲低降低侵袭（P = 0.0280），重新表达PPIB后侵袭显著增加（P = 0.0005），甚至超过对照组，可能反映了高水平的PPIB过表达。
PPIB敲低在裸鼠中与肿瘤生长减缓相关
将PC-3-sh-NC或PC-3-sh-PPIB-275细胞皮下植入裸鼠（每组5只）。在观察期内，sh-PPIB-275组异种移植瘤生长更慢，最终肿瘤重量（0.147 g 对 0.213 g，P = 0.0104）和体积（182.4 mm3 对 301.8 mm3，P = 0.0146）均显著低于对照组，而两组小鼠体重无显著差异。
PPIB敲低诱导PC-3细胞转录组变化
RNA-seq的主成分分析显示sh-PPIB与sh-NC样本明显分离。差异表达分析鉴定出570个显著改变的基因，其中384个上调、186个下调（FDR < 0.05）。GO富集显示上调基因主要涉及内质网应激、未折叠蛋白反应、转录调控和氨基酸转运；下调基因富集在DNA复制、同源重组修复、细胞周期调控和有丝分裂信号通路。GSEA显示sh-PPIB组中DNA修复、E2F靶点和G2/M检查点基因集显著负富集。代表性下调基因包括MCM2、MCM3、MCM4、RAD51、CDK2、FEN1、FAM111B和CEACAM6。qRT-PCR验证了10个DEG中的9个与RNA-seq方向一致。
PPIB敲低改变PC-3细胞的可变剪接
共鉴定出873个显著改变的可变剪接事件，其中内含子保留（IR）是最常见的类型。大多数基因只显示一个显著改变的剪接事件。剪接相关基因的GO富集显示涉及转录调控、蛋白质转运、DNA损伤反应、未折叠蛋白反应、染色质组织、细胞迁移和有丝分裂调控；KEGG富集涉及代谢通路、剪接体、自噬、SNARE介导的囊泡运输、雌激素信号和甘油酯代谢。候选基因ALKBH3、ITGB4、RBM6和SLC25A37被选出。事件特异性qRT-PCR验证了5个代表性剪接事件，其中4个（SHMT2、SLC25A37、RBM6、ALKBH3）与RNA-seq方向一致，GINS1事件未得到独立确认。
整合分析将PPIB与前列腺癌代谢通路改变联系起来
将DEGs和剪接相关基因取交集，得到22个在转录和转录后水平同时失调的基因。KEGG富集显示这些共失调基因显著富集于叶酸介导的一碳代谢、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸生物合成与降解、氨基酸合成、中心碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢以及抗叶酸耐药机制。SHMT2、PHGDH和GINS1被选为候选基因。其中SHMT2和PHGDH富集于代谢相关KEGG通路，其表达和剪接变化在图中展示，但PHGDH剪接事件仅来自RNA-seq分析，未经qRT-PCR验证。
讨论与结论
讨论部分强调，TCGA-PRAD分析显示PPIB mRNA在肿瘤中高表达，IHC探索性分析也提示肿瘤区域H评分较高，但配对患者水平分析未达到统计学显著性。在PC-3细胞中，PPIB敲低抑制增殖、迁移、侵袭和异种移植肿瘤生长，且shRNA耐药型PPIB重新表达可逆转迁移和侵袭缺陷，支持这些表型与PPIB耗竭的特异性关联。RNA-seq显示PPIB敲低导致DNA复制、同源重组修复和细胞周期相关基因下调，如MCM家族、RAD51、FEN1和CDK2，这与生长抑制表型一致。整合分析突出PHGDH和SHMT2等代谢调节因子，提示PPIB缺失可能影响丝氨酸生物合成和一碳代谢，进而影响核苷酸供应和氧化还原稳态。广泛的可变剪接改变，特别是内含子保留事件增多，提示PPIB可能参与转录后调控。然而，研究未进行RNA-蛋白质互作实验，因此无法区分直接结合还是间接效应。局限性包括：主要基于PC-3单细胞系，缺少其他前列腺癌细胞系验证；IHC样本量较小（15例）；GAPDH作为内参未经过稳定性验证；PHGDH剪接事件未经独立验证；凋亡相关标志物不完全一致，EMT标志物未形成统一模式；异种移植组织缺乏重复的蛋白分析。结论部分总结：PPIB可能促进前列腺癌进展，并与广泛的基因表达和可变剪接改变相关。在PC-3细胞中，PPIB敲低与增殖、迁移、侵袭和异种移植肿瘤生长降低相关。转录组分析显示DEGs富集于DNA修复、细胞周期调控和代谢通路。重新表达shRNA耐药型PPIB可逆转迁移和侵袭缺陷，进一步支持PPIB耗竭与这些表型的关联。这些结果为未来机制研究奠定了基础，包括在更多前列腺癌模型中的验证、使用独立shRNA和表达匹配的拯救系统，以及对候选下游因子的靶向功能分析。该论文发表在《Frontiers in Oncology》。
