GHSR与TLR4共同促进泡型棘球蚴病中的肝脏炎症与异常修复

《Frontiers in Immunology》：GHSR and TLR4 collectively promote hepatic inflammation and aberrant repair in alveolar echinococcosis

　　

背景与目的：泡型棘球蚴病（alveolar echinococcosis, AE）是一种致死性人兽共患寄生虫病，可通过慢性炎症、异常增殖性修复和肝脏纤维化导致进行性肝损伤。生长素分泌受体（growth hormone secretagogue receptor, GHSR）与Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）可分别调节肝脏炎症和增殖，但二者在多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis, E. multilocularis）诱导的AE中的协同作用尚不清楚。 方法：研究人员建立野生型（wild-type, WT）、GHSR敲除（GHSR-/-）和TLR4敲除（TLR4-/-）小鼠AE模型，于感染后12周对肝脏病理、细胞增殖、巨噬细胞极化、炎症因子和肝脏蛋白质组学特征进行综合评估。 结果：单独敲除GHSR或TLR4均可减轻AE诱导的肝脏病变、纤维化和肝功能障碍。机制上，二者缺失可抑制PI3K/Akt介导的增殖以及TLR4/MyD88/NF-κB介导的炎症，减少M1/M2巨噬细胞浸润，降低促炎细胞因子（IL-6、TNF-α和TGF-β1），并升高抗炎IL-10。研究人员在AE中证实GHSR与TLR4呈正相关表达，蛋白质组学进一步验证二者对肝脏炎症和异常修复的协调调控。 结论：总体上，上调的GHSR和TLR4通过维持持续炎症和失调的增殖性组织修复，共同促进多房棘球绦虫相关肝损伤。该研究揭示了GHSR与TLR4在AE进展中协同促病理的作用，并提供体内和蛋白质组学证据，支持针对寄生虫性肝病探索靶向干预。

研究背景方面，泡型棘球蚴病（AE）由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）幼虫感染引起，具有肿瘤样侵袭和进行性肝破坏，被称为“寄生虫性肝癌”。目前一线药物阿苯达唑（albendazole, ABZ）受低生物利用度、长期治疗和耐药限制，而对AE相关肝脏生长重塑与免疫失调机制认识不足，导致有效治疗靶点和规范干预策略缺乏。已有研究分别提示生长素分泌受体（GHSR，一种G蛋白偶联受体/GPCR）和Toll样受体4（TLR4，一种模式识别受体/PRR）在慢性肝病中可调节炎症、增殖和巨噬细胞极化，但二者在E. multilocularis诱导肝损伤中的协同表达模式和协同病理功能尚未阐明。因此，研究人员开展本研究以明确GHSR与TLR4在AE肝炎症和异常修复中的协调作用。

研究人员通过建立WT、GHSR^-/-和TLR4^-/-雌性C57BL/6小鼠感染模型，经门静脉注射原头节（protoscoleces, PSCs）后于12周分析，发现任一基因敲除均减轻病变、胶原沉积、糖原紊乱和肝功能损害，并伴随肝脏及血清生长素（ghrelin）下降。研究结论为：GHSR和TLR4上调并通过持续炎症与异常增殖修复共同促进AE肝损伤；二者构成协调致病程序，为寄生虫性肝病提供新机制和靶点。

主要关键技术方法方面，研究人员使用来自上海南方模式生物的WT、GHSR^-/-和TLR4^-/-雌性C57BL/6小鼠，经门静脉注射高活力PSCs建立感染队列，每组6只；采用苏木精-伊红（H&E）、Masson和三色染色、 Periodic acid-Schiff（PAS）染色进行病理与胶原和糖原分析；以免疫组化（IHC）、多重荧光免疫组化（mIHC）观察GHSR、TLR4、CD68、α-SMA、MyD88、NF-κB p65等空间共定位；以蛋白质印迹（WB）、定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测信号分子和细胞因子；以EdU标记评价肝细胞增殖；以非标记定量（label-free quantification, LFQ）蛋白质组学结合Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析比较WT与敲除组差异蛋白。

研究结果如下。3.1 GHSR deficiency attenuates hepatic injury during AE：研究人员通过大体标本、H&E、Masson、PAS及ALT/AST检测，得出GHSR^-/-小鼠病灶面积、胶原沉积、糖原蓄积和肝脾增大减轻，血清ALT、AST降低，说明GHSR缺失缓解寄生虫诱导肝损伤。3.2 GHSR exhibits spatial association with TLR4-related inflammatory and reparative signaling in infected livers：通过分子对接、mIHC共定位和LFQ蛋白质组学，研究人员发现GHSR与CD68、α-SMA、TLR4、MyD88、NF-κB p65空间相关；GHSR缺失后185个差异蛋白（DEPs）富集于NF-κB、PI3K/Akt和FcγR吞噬等通路。3.3 GHSR deficiency suppresses PI3K/Akt-driven proliferative remodeling in perilesional hepatic tissues：IHC、WB、qRT-PCR、EdU显示GHSR缺失降低ghrelin、p-PI3K、p-Akt、Ki67、PCNA、Cyclin D1/E1及增殖细胞比例，说明其抑制PI3K/Akt驱动的异常增殖重塑。3.4 GHSR deficiency remodels the hepatic inflammatory microenvironment and restrains TLR4/NF-κB activation：IHC、WB、qRT-PCR、ELISA表明GHSR缺失下调TLR4、MyD88、NF-κB p65、iNOS、Arg-1，减少IL-2、IL-6、TNF-α、TGF-β1，升高IL-10，抑制TLR4/NF-κB炎症并改善免疫微环境。3.5 TLR4 deficiency attenuates hepatic injury during AE：大体与组织学、肝功能分析显示TLR4^-/-小鼠病灶、胶原、糖原异常和ALT/AST损伤减轻，证明TLR4缺失同样保护肝脏。3.6 Proteomic analyses support coordinated involvement of TLR4 in inflammatory and metabolic remodeling：LFQ鉴定75个DEPs，TLR4缺失后差异蛋白富集于炎症介质调节TRP通道、肝癌、代谢过程和IL-1β产生调控，说明TLR4参与炎症与代谢重塑。3.7 TLR4 deficiency suppresses proliferative remodeling and reduces hepatic GHSR expression：IHC、WB、qRT-PCR、EdU显示TLR4缺失降低GHSR、ghrelin、p-PI3K、p-Akt及Cyclin D1/E1与增殖比例，表明TLR4可维持ghrelin–GHSR/PI3K–Akt促增殖轴。3.8 TLR4 deficiency restrains hepatic inflammation and restores immune homeostasis：研究人员发现TLR4缺失降低MyD88、NF-κB p65、CD68、iNOS、Arg-1，减少促炎因子并升高IL-10，虽晚期仍以M2为主，但巨噬浸润和慢性炎症减轻，免疫稳态恢复。

讨论部分总结：研究人员指出ghrelin/GHSR轴在慢性肝病中具有双重性；本研究中GHSR或TLR4缺失均降低对方表达及ghrelin水平，说明二者处于协调调控网络。E. multilocularis感染激活PI3K/Akt和TLR4/MyD88/NF-κB，引起“炎症—增殖—营养供给”前馈环路；GHSR作为连接TLR4/NF-κB炎症与异常增殖修复的核心枢纽，其缺失或TLR4间接抑制可打破该环路。蛋白质组学进一步证明二者重叠调控炎症、巨噬功能、代谢和修复。局限包括未证实GHSR与TLR4直接物理互作、未直接检测寄生虫活力、未解析肝细胞与巨噬细胞等细胞类型特异性功能。

研究结论部分翻译：总体上，本研究阐明了GHSR与TLR4在E. multilocularis感染中的协同促增殖和促炎功能及其协调功能关联。GHSR缺失通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号级联减轻感染诱导的肝脏增殖修复和慢性炎性损伤，从而改善AE相关肝病理损伤。尽管如此，本研究仍存在若干局限：GHSR与TLR4的精确分子互作机制尚待阐明；分子对接仅提供潜在结构关联而未经生化互作验证；研究聚焦宿主肝脏炎症与修复，未直接检测寄生虫存活，宿主微环境与寄生虫生存因果关系仍属推测；GHSR和TLR4在肝细胞、巨噬细胞及肝驻留细胞中的细胞类型特异性功能尚需系统探索。总之，该研究为GHSR与TLR4协同促病理作用提供系统的体内表型和蛋白质组学证据，为寄生虫性肝病治疗提供新机制见解和潜在治疗靶点。论文发表在《Frontiers in Immunology》。