《Frontiers in Environmental Science》：Environmental DNA metabarcoding revealing fish species diversity in the Zhelin Reservoir
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摘要：可靠的鱼类生物多样性基线对于大型亚热带水库的监测和适应性管理至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术提供了一种评估鱼类群落的非侵入性方法，但鄱阳湖流域柘林水库的分子基线信息仍然有限。本研究利用靶向线粒体12S rRNA基因的eDNA宏条形码技术，于2
摘要：可靠的鱼类生物多样性基线对于大型亚热带水库的监测和适应性管理至关重要。环境DNA（eDNA）宏条形码技术提供了一种评估鱼类群落的非侵入性方法，但鄱阳湖流域柘林水库的分子基线信息仍然有限。本研究利用靶向线粒体12S rRNA基因的eDNA宏条形码技术，于2023年12月对14个采样点的鱼类群落组成、多样性模式及探索性环境-群落关联进行了表征。共检出85个鱼类分类单元，隶属于6目12科59属，其中鲤形目（Cypriniformes）和鲤科（Cyprinidae）占优势。相对读取丰度最高的分类单元为细鳞斜颌鲴（Xenocypris microlepis）、鳙（Aristichthys nobilis）、鲫（Carassius auratus）、鲤（Cyprinus carpio）和草鱼（Ctenopharyngodon idella），表明多种广布鲤科鱼类的相对检出强度较高。经稀释标准化至388,125条读取的等深度后，上游区域的期望丰富度较高，而Shannon多样性、Simpson多样性和Pielou均匀度在水库各断面间无显著差异。Bray-Curtisβ多样性分析显示上游、中游和下游断面间无显著组成分离（PERMANOVA：R2 = 0.223，p = 0.160），PERMDISP表明多变量离散度相似（p = 0.379）。经方差膨胀因子筛选后的冗余分析（RDA）表明，实测环境变量与鱼类群落组成之间存在显著但探索性的关联（R2 = 0.600，p = 0.045），其中溶解氧表现出最强的单变量关联。总体而言，本研究为柘林水库鱼类群落提供了分子名录和监测基线，有助于未来重复调查和适应性水库管理。
**eDNA宏条形码技术在柘林水库鱼类多样性监测中的应用：分子基线建立与空间格局分析**
**一、研究背景与意义**
淡水生态系统承载着全球不成比例的高比例生物多样性，但正日益受到栖息地退化、过度开发、水文改变和气候变化的威胁。水库作为复杂的人-自然耦合系统，大坝运行、水位波动、纵向栖息地梯度、增殖放流和捕捞管理等因素共同塑造着鱼类群落结构。传统调查方法如刺网和电捕法受限于深度、分类选择性以及空间覆盖不足，常导致物种多样性评估偏差，且难以有效检测稀有、 elusive 或深水物种，同时可能对目标物种造成胁迫并改变其自然行为。环境DNA（environmental DNA, eDNA）宏条形码技术作为一种非侵入性且灵敏的水生生物多样性调查方法，通过捕获生物体脱落到水中的遗传物质实现物种检测，结合高通量测序可从单一水样中同时检测多个分类单元。柘林水库位于长江流域，水域面积308 km2，最大水深45 m，是江西省最大的人工湖，兼具饮用水源、洪水调蓄、旅游、渔业和生物多样性保护等重要生态和社会功能，同时也是鳡（Elopichthys bambusa）国家级水产种质资源保护区的一部分。尽管已有研究利用传统分类学、功能多样性、水声学调查及初步eDNA方法对该水库鱼类群落进行了探索，但仍缺乏一个标准化的位点尺度eDNA基线，将分子物种检出、空间群落相似性和实测环境梯度纳入统一采样设计。本研究旨在通过eDNA宏条形码技术表征14个采样位点的鱼类分类单元，评估上下游α多样性和β多样性的纵向差异，并探索群落组成与环境变量之间的关联，为柘林水库鱼类群落监测建立分子基线，补充传统和水声学调查，支持未来重复监测和适应性管理。
**二、主要关键技术方法**
研究人员在2023年12月对柘林水库14个固定采样点（上游S1–S4、中游S5–S9、下游S10–S14）采集水样，每位点采集3个邻近点和3个垂直水层（表层、表层下约1 m中层、沉积物上方至少2 m底层）各1 L水样，混合后分为3份技术重复子样本，分别过滤、提取DNA和PCR扩增。现场每批次设置1个空白对照，经PCR筛选无可见目标条带故未测序。采用Tele02 12S引物对（Tele02F/Tele02R）扩增线粒体12S rRNA基因片段，在Illumina MiSeq平台进行双端测序。生物信息学流程基于扩增子序列变体（amplicon sequence variant, ASV）而非97%操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）聚类，使用DADA2进行质量过滤和嵌合体去除，通过blastn比对MitoFish/mitogenomes数据库（v3.90，811,468条线粒体序列，覆盖42,015个物种）进行分类注释。统计分析在R 4.4.3中完成，包括α多样性指数计算、稀释标准化、单因素方差分析、基于Bray-Curtis和Jaccard距离的主坐标分析（PCoA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）、PERMDISP以及经方差膨胀因子（VIF）筛选后的冗余分析（RDA）。
**三、研究结果**
**3.1 鱼类物种组成**
基于12S rRNA标记基因的eDNA宏条形码分析，14个采样位点共检出85种鱼类，隶属于6目12科59属。目级水平上鲤形目占绝对优势，占总物种数的70.59%（60种），其次是鲈形目（Perciformes，16.47%，14种）和鲇形目（Siluriformes，9.41%，8种）。科级水平上鲤科（Cyprinidae）显著主导，包含54种，占总群落的63.53%。相对读取丰度（relative read abundance, RRA）最高的5个分类单元为细鳞斜颌鲴（Xenocypris microlepis）、鳙（Aristichthys nobilis）、鲫（Carassius auratus）、鲤（Cyprinus carpio）和草鱼（Ctenopharyngodon idella），均属鲤科且在所有14个采样位点均有检出，合计占鱼类总读取数的80.24%。
**3.2 鱼类物种多样性分析**
α多样性指数计算结果显示，Shannon指数范围为1.5599至2.0738，均值为1.8635；Simpson指数介于0.6637至0.7944之间，平均0.7434；Pielou均匀度指数范围为0.4122至0.5578，平均0.4819。经稀释标准化至等深度388,125条读取后，期望丰富度在水库断面间存在显著差异（ANOVA：F = 6.942，p = 0.011），上游断面显著高于中游和下游断面。相比之下，Shannon多样性（p = 0.624）、Simpson多样性（p = 0.261）和Pielou均匀度（p = 0.364）在上游、中游和下游断面间均无显著差异。这表明丰富度与均匀度相关指标呈现不同的空间信号，仅凭α多样性不足以推断群落同质化。
**3.3 β多样性与群落周转**
基于Bray-Curtis相异度的PCoA显示上游、中游和下游样本之间存在部分重叠，表明水库断面间的组成分离有限。PERMANOVA检测发现断面间鱼类群落组成无显著差异（R2 = 0.223，F = 1.581，p = 0.160），PERMDISP显示断面间多变量离散度无显著差异（F = 1.069，p = 0.379）。基于存在-缺失数据的Jaccard补充敏感性分析得出相似结论（PERMANOVA：R2 = 0.149，F = 0.965，p = 0.515；PERMDISP：F = 0.335，p = 0.683）。这些结果表明采样期间水库各断面间群落组成具有广泛相似性，但不支持断面间存在显著空间同质化的强论断。
**3.4 环境变量与鱼类群落组成的关系**
经VIF筛选后，温度、溶解氧、NH?-N、BOD?、叶绿素a和透明度被保留在RDA模型中，高共线性变量在最终模型拟合前被排除。最终RDA解释了Hellinger转换后鱼类群落组成变异的60.0%，且统计显著（R2 = 0.600，校正R2 = 0.257，F = 1.749，p = 0.045）。单变量RDA检验表明，溶解氧与群落组成具有最强的单变量关联（R2 = 0.208，F = 3.148，p = 0.013），而BOD?（R2 = 0.148，F = 2.092，p = 0.074）和叶绿素a（R2 = 0.142，F = 1.988，p = 0.076）呈较弱的趋势性关联。这些结果表明局部水质条件与鱼类群落组成的变异存在关联。
**四、讨论与结论**
**4.1 讨论**
本研究中eDNA宏条形码检出的鱼类组成以鲤形目和鲤科为主导，与近期基于传统分类学和功能多样性的研究结果基本一致。与适合评估鱼类密度和聚集模式但分类分辨率有限的水声学调查相比，eDNA宏条形码为检出群落的分类组成提供了直接的分子证据。与传统调查相比，eDNA方法具有可标准化位点尺度采样、非侵入性、可跨断面提供分类单元水平分子检出等优势，但也有其局限性：eDNA检出不等同于捕获个体、生物量或种群规模，且受DNA脱落、输移、降解、引物性能和参考数据库完整性等因素影响。因此本研究构建的eDNA名录应视为分子生物多样性基线，补充而非取代传统和水声学调查。
与基于相对重要性指数（index of relative importance, IRI）的传统渔获物调查相比，两组数据在科级和群落水平上具有一致性，但优势种不完全对应。本研究RRA最高的5个分类单元均为鲤科且广泛分布，其中鳙在两组数据中均突出；草鱼、鲫和鲤在传统调查中被列为重要种，但传统渔获物调查中的优势种贝氏?（Hemiculter leucisculus）和似鳊（Xenocypris davidi）未出现在eDNA数据的前5位RRA分类单元中，而细鳞斜颌鲴在本研究中表现出最强的分子检出信号。这种差异源于两种方法原理的不同——IRI基于数量百分比、生物量百分比和出现频率，而eDNA排序基于相对读取丰度，后者可能受物种特异性DNA脱落、降解、输移、引物扩增效率和参考数据库分辨率的影响。因此，高RRA分类单元应解释为优势检出分类单元或强分子信号，而非数量或生物量优势的直接证据。
β多样性分析和RDA的综合应用表明，eDNA不仅可用于列出检出分类单元，还可在统一采样框架下评估空间相似性和筛选候选环境相关因子。2023年12月调查中鱼类群落呈现广泛空间相似性和弱断面级分化，这一模式与水库内水文连通性、栖息地连续性以及广布性鲤科鱼类普遍存在更为一致，而非强烈的纵向群落更替。RDA分析中溶解氧表现出最强单变量关联，提示局部氧条件可能与eDNA推断的鱼类组成样本间变异相关，而BOD?和叶绿素a可能反映与有机质需求和初级生产力相关的较弱梯度。然而，这些关联不应被解释为直接因果机制，因为本研究基于单次12月采样，未明确模拟水动力学、栖息地结构、鱼类运动和放流位置。弱断面级分化和RDA结果的探索性表明，需要季节性重复采样、局部参考数据库改进、传统鱼类调查和水声学验证，才能推断恢复动态或因果驱动因素。
**4.2 结论**
本研究利用eDNA宏条形码技术在柘林水库检出85个鱼类分类单元，为水库鱼类群落监测提供了分子基线。稀释标准化后的丰富度在上游较高，而Shannon多样性、Simpson多样性和Pielou均匀度在水库断面间无显著差异。β多样性分析显示上、中、下游断面间无显著组成分离或离散度差异，表明2023年12月调查期间群落具有广泛空间相似性和弱断面级分化。经VIF筛选后的RDA表明实测环境变量与群落组成之间存在显著关联，溶解氧表现出最强单变量关联。总体而言，eDNA宏条形码是水库尺度生物多样性监测的有效非侵入性工具。未来的管理导向监测应结合固定季节性eDNA调查、带测序阴性对照的现场空白、传统鱼类调查、水声学评估以及当地放流或栖息地管理记录，以便随时间更稳健地评估鱼类群落组成的变化。
