茉莉酸诱导尼古丁生物合成中由负反馈级联调控的揭示：基于平板内尼古丁检测法

《Molecular Horticulture》：A negative feedback cascade controlling jasmonate-induced nicotine biosynthesis revealed by an in-plate nicotine assay

　　

尼古丁是烟草中赋予抗草食动物防御的主要生物碱。尼古丁生物合成的激活由茉莉酸（JA）信号转录因子NtMYC2s介导，其特异性结合尼古丁生物合成基因启动子中的G-box。既往研究多关注NtMYC2a的正向功能，本研究报道NtMYC2a在调控JA诱导尼古丁生物合成中的负向作用。研究人员此前观察到NtMYC2a过表达（NtMYC2a-OE）烟草打顶诱导的尼古丁升高未高于对照，怀疑NtMYC2a参与防止尼古丁过度积累的负反馈机制。为探究机制，研究人员建立了平板内尼古丁生产检测法（IPNPA），用固体MS培养基加MeJA评估烟草苗尼古丁合成能力；野生型在3 μM MeJA下积累11.7 μg/mg、5 μM下18.1 μg/mg，选3 μM用于后续。IPNPA经low-nicotine nic突变体验证可靠，用于分析NtMYC2a-OE：其基础尼古丁5.2 μg/mg、MeJA下12.6 μg/mg，对照3.1→11.0 μg/mg，JA诱导增幅约140%显著低于对照260%；NtMYC2a-RI基础低但增幅同对照，证明过表达限制JA诱导生产。qRT-PCR显示NtMYC2a-OE中NtODC与NtADC（分别编码鸟氨酸脱羧酶与精氨酸脱羧酶）的JA诱导表达被抑制，而NtPMT、NtQPT、NtA622、NtBBL高于对照。研究人员用NtMYC2a-OE与NtODC1-OE/NtADC1-OE杂交获共表达株：无MeJA约7.0 μg/mg、有MeJA约20.0 μg/mg，增幅185%，高于NtMYC2a-OE的120%，说明NtODC1/NtADC1共表达提振JA诱导生产。富氮下NtMYC2a-OE 7.1→18.0 μg/mg（154.5%）；共表达株约8.0→30.0 μg/mg（>260%），共表达与供氮协同促增；但富氮MeJA下共表达株现坏死黑斑，或为高产尼古丁自毒，且氮增强的若干生物合成基因表达倍数回落，属防控过量的反馈伤害反应。启动子生信找得NtODC1三个G-box（PODC1-G1/G2/G3）、NtADC1四个（PADC1-G1/G2/G3/G4）；EMSA用His-NtMYC2a见PODC1-G1/G2与PADC1-G1/G2/G3移位，G3/G4及突变探针无移位。ChIP（HA-NtMYC2a加抗HA）示体内结合：PODC1-G1 2.0%→2.8%、G2 2.9%→5.2%；PADC1-G1G2 2.5%→9.5%、G3 2.0%→3.9%；G3/G4及NtActin约0.6%，MeJA增强结合。瞬时激活（GUS）中PODC1-N、PADC1-N/dG1在苗根都表达且OE中更强；缺JA时NtMYC2a主要靠PODC1-G1与PADC1-G1/G2激活；MeJA在对照增强这些启动子GUS、在OE中抑制。研究凭IPNPA厘清NtMYC2a介导NtADC/NtODC表达“刹车”JA诱导尼古丁合成，及共表达与供氮协同；并推想尚有未明抑制子介JA制动。该工作揭示NtMYC2a-NtADC/NtODC级联新功能，确立其与启动子分子互作。

研究背景方面，尼古丁是烟草中主要生物碱，赋予植物抗草食动物防御能力。尼古丁生物合成由茉莉酸（JA，jasmonate）信号转录因子NtMYC2s激活，其结合尼古丁生物合成基因启动子中的G-box。已有文献多聚焦NtMYC2a正向功能，但研究人员在NtMYC2a过表达（NtMYC2a-OE）烟草打顶诱导尼古丁升高未高于对照的现象中，怀疑NtMYC2a参与防止尼古丁过度积累的负反馈机制。为解释该现象，研究人员开展本研究，论文发表于《Molecular Horticulture》。

主要关键技术方法方面，研究人员以野生型TN90、空载体对照、NtMYC2a-OE、NtMYC2a-RI、low-nicotine nic突变体、NtODC1-OE与NtADC1-OE及其与NtMYC2a-OE杂交获得的共表达株为材料；建立平板内尼古丁生产检测法（IPNPA，in-plate nicotine production assay）评估固体MS培养基加甲基茉莉酸（MeJA，methyl jasmonate）下的尼古丁合成；联合定量逆转录PCR（qRT-PCR，quantitative reverse transcription PCR）、电泳迁移率变动分析（EMSA，electrophoretic mobility shift assay）、染色质免疫沉淀（ChIP，chromatin immunoprecipitation）与GUS报告基因瞬时激活分析，解析NtMYC2a对NtODC1/NtADC1启动子的结合与转录调控。

研究结果方面，NtMYC2a-mediated feedback regulation of JA-induced nicotine biosynthesis部分显示，IPNPA中野生型TN90在3 μM MeJA积累11.7 μg/mg尼古丁、5 μM为18.1 μg/mg，选3 μM因可激活合成且生长抑制较轻；NtMYC2a-OE基础5.2 μg/mg、MeJA后12.6 μg/mg，JA诱导增幅约140%，显著低于对照260%，NtMYC2a-RI基础低但增幅同对照，说明NtMYC2a过表达限制JA诱导尼古丁生产；qRT-PCR表明NtODC与NtADC的JA诱导表达在OE中被抑，NtPMT、NtQPT、NtA622、NtBBL则高于对照。共表达NtODC1/NtADC1的NtMYC2a-OE无MeJA约7.0 μg/mg、MeJA约20.0 μg/mg，增幅185%，高于OE自身120%且近似对照或单过表达株，证明NtODC1/NtADC1共表达恢复并提振JA诱导生产。富氮下NtMYC2a-OE为7.1→18.0 μg/mg（154.5%），共表达株约8.0→30.0 μg/mg（>260%），共表达与氮供应协同促增；但富氮MeJA下共表达株现坏死黑斑，提示过量尼古丁自毒，且氮增强的若干生物合成基因倍数回落，是植物控过产的伤害性反馈。

To determine how NtMYC2a regulate NtODC1/NtADC1 expression部分中，生信找得P_ODC1-G1/G2/G3与P_ADC1-G1/G2/G3/G4；EMSA用His标签NtMYC2a见P_ODC1-G1/G2、P_ADC1-G1/G2/G3明显移位，P_ODC1-G3、P_ADC1-G4及突变探针无移位；ChIP用HA-NtMYC2a和抗HA抗体显示体内富集：P_ODC1-G1由2.0%升至2.8%、G2由2.9%升至5.2%，P_ADC1-G1G2由2.5%升至9.5%、G3由2.0%升至3.9%，P_ODC1-G3、P_ADC1-G4与NtActin约0.6%，MeJA增强体内结合。

In transactivation assay部分中，P_ODC1-N与P_ADC1-N/dG1在对照和OE的苗与根均驱动GUS，OE染色更强、活性更高；P_ODC1-dG1与P_ADC1-dG1G2在OE中上调较弱，P_ODC1-dG1G2与P_ADC1-dG1G2G3几乎检测不到。缺JA时NtMYC2a主要靠P_ODC1-G1与P_ADC1-G1/G2激活表达；MeJA在对照增强这些报告子、在OE中抑制，和生理结果一致。

讨论与结论部分，研究人员认为IPNPA可便捷可靠评价烟草尼古丁生产，本研究厘清NtMYC2a介导NtADC/NtODC表达“刹车”JA诱导尼古丁生物合成，并揭示NtADC1/NtODC1共表达与增氮协同调制该抑制。基于NtMYC2a协调NtADC1/NtODC1表达与氮代谢，研究人员推测尚有未鉴定抑制子参与JA诱导制动NtMYC2a调控的尼古丁合成。结论为：该工作揭示NtMYC2a-NtADC/NtODC级联在尼古丁生物合成中先前未知的功能，并建立NtMYC2a与NtADC1/NtODC1启动子间的分子互作。