低温触发HktS-HktR信号通路促进丁香假单胞菌猕猴桃致病变种中RpoD介导的T3SS毒力激活

《Phytopathology Research》：Cool temperature triggers HktS-HktR signaling to promote RpoD-mediated activation of T3SS virulence in Pseudomonas syringae pv. actinidiae

　　

猕猴桃细菌性溃疡病（KBC）由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）引起，严重影响猕猴桃生产。既往研究表明Psa在低温下毒力增强，但调控机制不清。鉴于组氨酸激酶（histidine kinase，HK）在细菌环境信号响应中的关键作用，生物信息学分析预测Psa中共有69个HK，其中hktS被鉴定为关键低温响应基因。结构分析与共转录实验显示HktS及其对应响应调节因子HktR构成功能性双组分系统（two-component system，TCS）。研究人员发现HktS与HktR关键磷酸化相关位点突变会损害低温感知并降低Psa毒力。进一步研究表明HktR直接与转录因子RpoD互作，并结合hrpRS启动子区保守基序，从而激活III型分泌系统（type III secretion system，T3SS）表达。遗传与表达分析显示HktS-HktR系统在供试菌株中具有保守低温响应表达模式，并在假单胞菌属（Pseudomonas）中高度保守。因此，研究人员鉴定出一个对Psa低温毒力必需的组氨酸激酶并阐明其分子机制，为猕猴桃细菌性溃疡病新型防控策略提供理论基础与潜在分子靶标。

研究背景方面，猕猴桃细菌性溃疡病（KBC）由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Psa）引起，低温如16 °C高湿可促进病原入侵增殖，而超过20 °C症状受抑，但Psa如何感知温度并调控毒力与生长的分子机制长期不明。III型分泌系统（T3SS）是Psa致病核心，其表达受HrpR/HrpS-HrpL级联控制，并受多个双组分系统（TCS）调制，但环境信号如何整合进hrpRS活性的具体机制未知。为此，研究人员以Psa M228为对象，系统鉴定低温响应HK，解析HktS-HktR-RpoD-hrpRS-T3SS通路，阐明低温毒力调控机制。

本文发表于《Phytopathology Research》。

关键技术方法方面，研究人员以陕西‘红阳’猕猴桃病叶分离的Psa M228及Pst DC3000、Psph 1448A、Pss B728a等P. syringae路径变种为材料，采用生物信息学域扫描与系统发育分析、qRT-PCR、同源重组缺失与互补、真空渗透叶片及枝条接种病害 assay、IP-质谱、GST pull-down、微量热泳（MST）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、等温滴定量热（ITC）及AlphaFold 3对接，验证基因、蛋白互作与启动子结合。

研究结果如下。

Bioinformatic prediction of 69 HKs in Psa genome：研究人员通过HMMER、SMART与CDD扫描Psa M228蛋白组，鉴定69个候选HK，含47个仅具HATPase_C的孤儿激酶与22个兼具HATPase_C和Response_reg的杂合激酶，系统发育聚类与域架构相关。

Identification of hktS as a cool-temperature responsive HK gene：qRT-PCR显示16 °C相对30 °C有9个HK上调，hktS（Psa11300）上调4.6倍；九基因缺失体中仅ΔhktS丧失低温毒力，其余八株保留野生型样毒力，表明hktS是低温响应与致病关键调节基因。

hktS-hktR regulates Psa virulence at cool temperatures：结构分析示HktS具HPT、H-kinase dim、HATPase_C与CheW域，HktR具REC域；RT-PCR证实两基因共转录成操纵子。ΔhktS与ΔhktR在16 °C叶片与枝条病斑显著减小，互补株恢复野生型水平；hrpR、hrpS、hrpL及效应基因avrE1、hopR1、hopZ5表达下调，说明hktS-hktR正向调控T3SS与低温毒力。

HktS-HktR phosphorylation-related signaling regulates Psa virulence at cool temperatures：预测HktS位点为H49、HktR为D56；磷酸化缺失突变hktS^H49A、hktR^D56A毒力近失，磷酸化模拟突变hktS^H49E、hktR^D56E恢复毒力与T3SS基因表达，证明位点特异性磷酸化是协调毒力与环境信号传导的分子开关。

RpoD interacts with HktR to regulate Psa virulence：质谱鉴出HktR互作方为持家σ因子RpoD；GST pull-down与MST（Kd=1.79 μM）确认直接结合。ΔrpoD近完全丧失叶片与枝条毒力，但LB中生长曲线正常；hrpR、hrpS、hrpL及效应基因严重下调，表明RpoD特异性调控毒力而非基本生长。

HktR regulates T3SS via RpoD-mediated hrpRS promoter：在ΔhktR背景下过表达rpoD可恢复T3SS表达；hrpRS启动子含保守RpoD结合基序AGGGTCTT，EMSA与ITC证实RpoD直接结合该启动子，说明HktR经RpoD直接激活hrpRS转录。

Conservation of the HktS-HktR TCS across Pseudomonas species：系统发育与比对显示HktS/HktR同源物在P. syringae路径变种成单系簇且广布假单胞菌属；Pst DC3000、Psph 1448A、Pss B728a中同源基因均呈相似低温诱导，提示该模块是假单胞菌属温度适应的保守调控单元。

讨论部分总结：研究人员指出温度感应HK调控毒力在细菌中广泛存在，但HktS-HktR以磷酸化依赖方式把温度感知与毒力调控独特整合。单基因缺失表型支持二者同属一个TCS，但双缺失与互补尚缺，未来需补证协同或上位关系。HktS-HktR主要作用于hrpRS-hrpL主调控节点而非直接调控效应基因。HktR无DNA结合域而借蛋白互作调控σ⁷⁰因子RpoD，是TCS直连通用转录机器的非经典机制；Psa中ΔrpoD不致死可由rpoS上调补偿解释。同源系统虽序列保守，但是否在整个假单胞菌属均作低温毒力开关仍待更多低温病原株验证。HktS如何物理感知温度、是否直接磷酸化HktR及磷酸化如何重排HktR-RpoD复合体，仍需生化与结构证明。

结论部分翻译：本研究在Psa中鉴定并表征新型双组分系统HktS-HktR。该系统是感知低温的特异性分子开关，磷酸化关键位点对低温毒力增强必不可少。HktR无DNA结合域，转而直接互作持家σ因子RpoD；RpoD结合hrpRS启动子保守基序，激活下游HrpRS-HrpL-T3SS毒力级联。HktS-HktR在假单胞菌属进化保守，暗示其在相关植物病原温度适应中作用更广。总之，研究揭示双组分系统直接对接通用转录机器、把环境温度感知与毒力控制整合的前所未知机制，深化细菌热适应认识，并将HktS激酶确立为防治猕猴桃细菌性溃疡病的有前景分子靶标。