《Lasers in Medical Science》：Low-level laser irradiation stimulated tumoricidal impacts and dose-dependent modulation of Wnt signaling in three-dimensional human colorectal cancer microspheres
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结直肠癌(CRC)的高发病率一直是人类医学中的重大挑战。除现有疗法外，低能级激光照射(LLLI)等特定手段被用于获得适宜再生结果。遗憾的是，多数研究在二维(2D)培养系统中评估LLLI对癌细胞的杀肿瘤效应，与体内条件可比性有限。研究人员在藻酸盐-明胶(Alg-
结直肠癌(CRC)的高发病率一直是人类医学中的重大挑战。除现有疗法外，低能级激光照射(LLLI)等特定手段被用于获得适宜再生结果。遗憾的是，多数研究在二维(2D)培养系统中评估LLLI对癌细胞的杀肿瘤效应，与体内条件可比性有限。研究人员在藻酸盐-明胶(Alg-Gel)微球内封装人CRC细胞，于48 h后研究LLLI的损害性影响。Alg(1% w/v)-Gel(1% w/v)微球通过CaCl?介导离子交联制备，表征了溶胀率、降解率、凝胶分数、傅里叶变换红外光谱(FTIR)和扫描电镜(SEM)形貌。HT-29载细胞微球平均直径与细胞分布经明场显微镜评估；48 h后以2和80 J/cm2照后，乳酸脱氢酶(LDH)释放试验和Griess试验分别评估细胞膜完整性与一氧化氮(NO)生产；苏木精-伊红(H&E)染色评估细胞密度，逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)评估Wnt相关基因表达。FTIR证实Alg与Gel整合，复合材料具可测溶胀、降解、凝胶分数特征及多孔互连超微结构；微球平均直径305.85 ± 19.07 μm，细胞分布于整个微球。80 J/cm2照射伴LDH释放增加、NO生成升高及HT-29密度降低(p < 0.05)；2 J/cm2呈温和且依检测而定的细胞保护模式。RT-qPCR显示Wnt相关基因上、下调混合转录响应，其本身不能确立Wnt信号通路激活。LLLI可通过生存率、亚硝基化应激和某些Wnt信号基因影响人CRC细胞动态生长，可助临床治疗协议制定。
研究背景方面，结直肠癌(CRC)在发展中国家与工业化国家均具高发病与高死亡负担，是肿瘤相关死亡第三大原因。临床常规依赖结肠镜早筛，治疗以手术、化疗±放疗、免疫治疗为主，但常难彻底清除肿瘤细胞。光生物调节(photobiomodulation)中低能级激光照射(LLLI)已被用于口腔炎缓解、淋巴水肿等癌症相关并发症，但LLLI对肿瘤本身可呈“促瘤-杀瘤”双向作用，且关键取决于波长、能量、强度与肿瘤类型。既有LLLI抗癌研究多在二维(2D)单层培养中进行：细胞平铺、细胞间通讯弱、代谢与药敏失真，难以重现体内异质性与基质微环境。因此，研究人员以海藻酸-明胶(Alg-Gel)离子交联微球构建三维(3D)人CRC模型，用HT-29细胞评估LLLI剂量依赖效应，论文发表于《Lasers in Medical Science》。
主要关键技术方法上，研究人员取伊朗国家细胞库HT-29人结直肠癌细胞，构建常规2D培养与Alg-Gel微球3D培养两套体系；以632.2 nm连续波二极管激光按2与80 J/cm2两档辐照，2D贴壁与3D微球采用不同光斑半径、辐照面积与曝光时间；辐照后换1% FBS低血清培养基孵育48 h；以MTT评2D活力，LDH漏出评3D膜完整性，Griess评NO/亚硝基化应激，H&E评细胞密度，RT-qPCR评DAAM1、DKK1/3、FZD1/2、GSK3B、MMP7、TCF7、WNT1/3A/5B等Wnt轴基因；材料端以FTIR、SEM、溶胀/降解/凝胶分数表征水凝胶。
研究结果中，FTIR revealed the successful integration of Alg with Gel：FTIR显示Alg的-COO?对称伸缩与Gel的酰胺Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ带共存于Alg-Gel谱中，证明Ca2?离子交联下两者成功整合。Physicochemical properties：Alg-Gel在PBS中溶胀率由1 h的286.37 ± 89.20%升至72 h的800.94 ± 76.67%；含溶菌酶PBS中降解率由第3天25.19 ± 2.64%增至第12天62.56 ± 1.53%；凝胶分数54.57 ± 2.53%，提示约半数聚合物质量保留为稳定网络。Cell incorporation into Alg-Gel microspheres：明场下微球尺寸均一，HT-29均匀分布，平均直径305.85 ± 19.07 μm；因溶胀/降解发生在天级而非小时级，48 h生物窗口内结构稳定。SEM imaging：SEM见Gel strand随机分布于Alg基质，截面呈层状互连孔隙；48 h后细胞贴附、展平并形态适应基质。LLLI exerted fluence-dependent changes in 2D- and 3D-cultured HT-29 cells：2D的MTT示2 J/cm2存活升高、80 J/cm2无显著优于对照；3D的LDH示80 J/cm2泄漏最大(p < 0.05)，2 J/cm2近对照，呈强度双相性。LLLI increased NO levels at higher intensities in 2D and 3D culture systems：2 J/cm2 NO不升甚至低于对照，80 J/cm2在2D与3D均显著升压硝基化应激(p < 0.05)。Histological examination revealed the toxic effects of high LLLI：H&E示80 J/cm2细胞密度下降(p < 0.05)，2 J/cm2每高倍野细胞数最高，低强度促存活、高强度杀瘤。LLLI altered the expression of Wnt signaling pathway genes：2 J/cm2下TCF7(14.19倍)、GSK3β(6.06倍)、DKK1(3.12倍)上调，WNT3A(-3.10倍)、WNT5B(-2.89倍)、MMP7(-2.76倍)下调；80 J/cm2下DAAM1(16.12倍)、GSK3β(15.86倍)、TCF7(6.93倍)、WNT3A(4.81倍)、DKK1(7.58倍)、DKK3(2.22倍)等混合上调。研究人员强调该混合转录谱含DKK与GSK3B等抑制性信号，不能单凭mRNA断言经典Wnt/β-catenin激活。
讨论部分总结中，研究人员指出2D局限使外推体内不可靠，Alg-Gel 3D具细胞黏附位点、互连孔隙与细胞-细胞作用，更近似肿瘤微环境；80 J/cm2微球曝光约1098.74 s（约18.3 min），累积热效应不能排除，降低存活未必纯非热光化学机制；NO升高符合亚硝基化应激，NO与Wnt/β-catenin存在双向互作但仅为关联；Wnt轴受配体-受体、DKK、GSK3β、β-catenin稳定性、TCF/LEF转录多层调控，仅凭RT-qPCR混合上/下调不能定论通路激活或抑制，需总/活性β-catenin、磷酸化GSK3β、DKK蛋白、TCF/LEF报告基因与功能扰动验证；局限还包括未测表面温度、单细胞系、缺蛋白水平与额外剂量。
结论部分翻译：本研究中，LLLI对封装于Alg-Gel水凝胶微球的人CRC HT-29细胞产生剂量依赖、双峰效应。低强度剂量（2 J/cm2）伴随温和且依检测而定的细胞保护趋势，高强度剂量（80 J/cm2）通过增强亚硝基化应激降低细胞存活。研究人员认为这些变化伴随多个Wnt信号通路效应因子的转录调控。当前数据来自单株CRC细胞系的体外观察，属初步且假设生成性质。监测LLLI精确评价要素（直接温度验证、不同激光剂量、Wnt信号通路组分蛋白变化）并纳入其他相关细胞系，可深化对3D培养系统中LLLI影响的理解。在限定条件下，所述Alg-Gel微球系统是可用的、有效的3D平台，适于CRC中激光光疗的剂量学与机制研究。发现属初步且假设生成，须以实时热监测、蛋白与功能通路 assay、附加辐照量及其他结直肠癌模型验证。
