电荷切换型可电离脂质降低脂质纳米颗粒的毒性

《Nature Nanotechnology》：Charge-switching ionizable lipids lower the toxicity of lipid nanoparticles

　　

脂质纳米颗粒（LNP）作为核酸递送载体具有巨大潜力；然而，其会触发炎性细胞因子产生，从而限制医学应用。开发非炎性LNP具有挑战性，因为LNP的可电离脂质与内体破坏过程既是LNP毒性的主要来源，又是递送核酸所必不可少的因素。研究人员证明，含有羧酸与胺（称为S-lipid）的可电离脂质可在pH 7.4与4.0之间切换带电状态，由此形成LNP（称为switchable nanoparticles），其可高效包载核酸并触发内体释放，且不激活TLR4、补体、galectin-8与血小板活化因子（PAF）信号通路。最后，研究人员证明switchable nanoparticles因不会加剧既往炎症，在脂多糖（LPS）诱导急性肺损伤治疗中优于传统LNP。综上，负电性可电离脂质可降低LNP毒性。

《Nature Nanotechnology》刊发的该研究围绕脂质纳米颗粒（LNP，lipid nanoparticle，用于核酸递送的纳米载体）的炎症毒性难题展开。研究背景方面，LNP–mRNA复合物虽具备治疗多种疾病所需的转染效率与组织趋向性，但除疫苗外临床转化缓慢，原因是LNP会通过补体级联、TLR4信号、galectin信号以及触发血小板活化因子（PAF）释放等多条途径诱发毒性；且阳离子可电离脂质的正电荷虽利于结合mRNA、形成蛋白冠与内体释放，却会激活补体、TLR4等炎症通路，内体破坏也会激活galectin-8与PAF。更关键的是，许多需LNP治疗的患者已存在既往炎症，LNP会加剧炎症恶化（IE，inflammation exacerbation），导致无法慢性或高剂量给药。传统LNP面临核酸递送效率与毒性之间的权衡困境，因此亟需开发低毒且高效的非炎性LNP。

研究人员设计并合成含单个叔胺与羧酸的开关型脂质（S-lipid，switchable lipid），其在pH 7.4呈负电、pH 4.0呈正电，据此制备开关型纳米颗粒（SNP，switchable nanoparticle）。结论显示，SNP可高效递送mRNA与质粒DNA（pDNA，plasmid DNA）而不激活TLR4、补体、galectin-8与PAF通路；在LPS预处理小鼠、人外周血单核细胞（PBMC，peripheral blood mononuclear cell）及LPS诱导急性肺损伤模型中，SNP在保持递送效率的同时显著降低免疫刺激，且IL-22 mRNA–SNP治疗效果优于传统LNP。该工作表明，将可电离脂质头基工程化为pH 7.4负电，可打破“效率—毒性”权衡，对核酸药物特别是炎症状态患者用药具有重要意义。

主要关键技术方法如下：构建144种S-lipid库并在HEK细胞中进行荧光素酶mRNA转染高通量筛选；以Top 18 SNP在小鼠体内行荧光素酶/hEPO mRNA递送与评价；采用LPS预处理BALB/c与C57BL/6小鼠及健康供者PBMC（n=4）评估炎症恶化与细胞因子；利用galectin-8-YFP报告细胞、TLR4报告基因细胞、人血清补体C3a检测、PAF释放检测与Rab11⁺/EEA1/LAMP1共定位示踪内体运输；以LPS气管诱导急性肺损伤小鼠模型比较E20-SNP与传统LNP包裹IL-22 mRNA的治疗作用。

High-throughput synthesis identifies S-lipids that efficiently deliver mRNA in vitro

研究人员合成144种S-lipid并筛选HEK细胞荧光素酶mRNA递送，发现头基胺与羧酸间需6–8碳连接子、具分支疏水尾与内间隔子，环氧化物类优于丙烯酸酯类；Top 18纯化后转染HEK与小鼠原代成纤维细胞，11/18效率媲美cKK-E12与SM-102，SNP的pK_a为4.2–5.8，pH 7.4下ζ电位较MC3-DLin更负，证明pH 7.4负电脂质亦可高效递mRNA。

SNPs can deliver nucleic acids efficiently in vivo with low toxicity

Top 18 SNP小鼠体内递送荧光素酶mRNA，部分效率等同/超过MC3-DLin，具肝脏趋向；E20-SNP递hEPO mRNA血药达600 mU ml^?1。LPS预处理小鼠中，MC3-DLin、SM-102、cKK-E12引发IL-6、IL-1β、MIP-2飙升，E20-SNP不升高且动物状态正常。pDNA实验中MC3-DLin LNP组24 h内全部死亡，E20-SNP–pDNA组7天存活且持续表达荧光素酶，显示低毒高效。

SNPs have a unique combination of high transfection efficiency and low immunostimulatory effects in human PBMCs

健康供者PBMC中，MC3-DLin、4A3-SC8、ALC-0315、SM-102、cKK-E12诱导多种细胞因子，E20-SNP在2000 ng ml^?1下不诱生所测14种细胞因子，同时荧光素酶信号高于部分传统LNP，是唯一兼具高转染与低免疫刺激的组合。

SNPs do not activate the galectin-8, TLR4 and complement signalling pathways and also do not trigger the release of PAF

人血清补体C3a实验与TLR4报告细胞显示E20-SNP不激活补体/TLR4；galectin-8-YFP细胞中传统LNP致内体galectin-8招募，E20-SNP极少；PBMC中传统LNP促PAF释放而SNP不触发。 trafficking显示SNP富集于Rab11⁺内体（再循环内体标记），而非强膜破坏，故可胞质释放而不激活galectin-8/PAF。

SNPs containing IL-22 mRNA are better at treating mice suffering from acute lung injury than traditional LNPs

LPS气管预处理的急性肺损伤小鼠中，E20-SNP–IL-22 mRNA完全挽救肺通透表型、肺蛋白渗漏与细胞浸润降至健康水平；传统LNP虽递送效率相近，但因加剧炎症仍见肺损伤。SNP优势源于低免疫刺激而非递送能力不足。

Conclusion

研究人员表明，含单个叔胺与羧酸的可电离脂质可生成高效低毒SNP，其避免补体、TLR4、galectin-8与PAF激活；但S-lipid细胞内代谢与蓄积未研究，慢性给药可能蓄积，未来可在疏水尾引入酯键加速清除。该类单胺单羧酸脂质在mRNA与pDNA递送中具有广泛药物递送潜力。

讨论部分总结：论文指出SNP通过头基负电避免血液期补体/TLR4激活，通过Rab11⁺内体非破坏式释放避免galectin-8与PAF激活，从而化解效率—毒性矛盾；局限在于未评估S-lipid代谢蓄积与慢性毒性，并给出引入可水解酯基团以加快消除的改进方向。研究结论部分译文如上“Conclusion”段所示：含单个叔胺和羧酸的可电离脂质能产生高效低毒的SNP；S-lipid降低了mRNA与pDNA在多种细胞及动物模型中的毒性，具有药物递送应用前景，但需关注长期蓄积风险。