综述：从细胞计数到细胞间相互作用：Cu-Cyto与共定位指数作为直肠癌肿瘤免疫微环境的空间分析框架

《International Journal of Clinical Oncology》：From cell counts to cellular interactions: Cu-Cyto and the co-localization index as a spatial framework for the tumor immune microenvironment of rectal cancer

　　

结直肠癌的肿瘤免疫微环境已成为患者预后的主要决定因素，其中肿瘤浸润淋巴细胞，尤其是CD8? T细胞，介导抗肿瘤免疫。基于密度的标准化指标（如Immunoscore）已显示出预后价值，但无法捕捉构成免疫-肿瘤生物学基础的细胞间空间相互作用。研究人员引入了一个整合两条互补分析轴的深度学习框架：Cu-Cyto，一个基于深度学习的图像细胞计量平台，能够从标准免疫组织化学染色的全切片图像中检测并分类约二十种细胞类型，采用位模式核滤波算法防止重复计数，并采用脱靶标记策略实现精确的核中心定位；以及共定位指数（Co-Localization Index, CLI），该指数将Cu-Cyto产生的分类概率和坐标转化为两种或三种细胞类型之间共定位的单一定量指标。研究人员通过接受新辅助放化疗（neoadjuvant chemoradiotherapy, NACRT）治疗的直肠癌中的CD103?CD8?组织驻留记忆样T细胞来阐释该框架：其基质区而非肿瘤内的密度可独立预测无复发生存期。这种差异无法仅通过分区感知密度来解释，促使研究人员提出一种能够捕捉区内空间关系的指标。共定位指数可自然扩展至三细胞相互作用，为CD103?CD8? T细胞、肿瘤细胞和基质成分之间的三细胞生物学提供定量读数。在独立直肠癌队列中进行的前瞻性验证，涉及观察等待器官保留和辅助化疗决策，将决定这一空间-细胞框架能否转化为常规临床决策支持，并有可能扩展到其他实体瘤情境。

Cu-Cyto：用于细胞水平量化的深度学习平台

Cu-Cyto是一个基于深度学习的图像细胞计量（deep learning-based image cytometry, DL-IC）平台，旨在从多重免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）或苏木素（hematoxylin, H）染色的全切片图像中识别并量化多种细胞群体。该流程整合四个阶段：高分辨率数字扫描仪图像采集、图像归一化预处理、使用卷积和残差神经网络进行细胞检测与分类，以及对检测细胞的后续空间分析。在直肠癌的实施中，免疫组织化学采用抗CD8和抗CD103抗体的双色显色染色，该标记组合可直接区分CD103?CD8?、CD103?CD8?和CD103?CD8?免疫表型，但Cu-Cyto并不局限于这一抗体配置。约二十种细胞类型并非由每种细胞类型对应一种抗体来定义；在当前实施中，分类器结合双染信息、形态学和组织背景进行解析，其中部分细胞类型具有较高的分类准确度。由于大多数细胞类型通过形态学和组织背景而非抗体染色加以区分，可解析的细胞类型数量不受标记物数量的限制。

两项算法创新支撑了Cu-Cyto的准确性。位模式核滤波算法通过将全切片图像划分为18.3 × 18.3 μm的网格，并通过核匹配迭代合并相邻的候选细胞像素，从而抑制在细胞边界不清晰或细胞密集区域的多重计数。开/关值表示每个网格点处检测到的细胞存在与否，而非标记蛋白水平的二值化结果，因此在该核滤波步骤中无需定义或设定标记蛋白量的截断值。脱靶标记策略在训练过程中强化核定位：标注人员在每个核中心放置标记点，而核周边区域被明确标记为脱靶，迫使网络学习高精度的核中心定位，从而改善对接触和重叠细胞的区分能力。

此外，Cu-Cyto的分类器通过跨连续队列的迭代训练逐步优化，每一轮都扩展分类器所遇到的组织背景、染色模式和罕见细胞表型的多样性。细胞类型标注由经过培训的标注人员在病理医师审核下完成，并通过过采样来缓解类别不平衡问题，尤其是对CD103?CD8?组织驻留记忆样肿瘤浸润淋巴细胞（tissue-resident memory-like tumor-infiltrating lymphocytes, T_RM-like TILs）等代表性不足的群体。这种迭代、审核耦合的训练是Cu-Cyto的核心运行原则而非一次性步骤。

Cu-Cyto的细胞分类性能已通过网格水平（18.3 × 18.3 μm）的F1分数进行评估。随着训练数据集的逐步扩展，所有评估细胞类型的F1分数均有所提高，CD8? T细胞达到0.911，淋巴细胞达到0.889，腺癌细胞达到0.589。腺癌细胞较低的数值反映了其跨组织学亚型的形态学多样性以及缺乏特异性免疫组织化学标记物。与此一致，免疫组织化学染色细胞的表现始终优于非免疫染色群体，反映了免疫组织化学对分类准确度的贡献。

两个实用特性支持Cu-Cyto在规模化生物标志物开发中的应用。首先，基于标准明场免疫组织化学而非专用多重成像平台运行，保持了较低的每标本成本，并与常规临床病理工作流程兼容，使分析能够扩展到将空间特征与长期预后及多种临床病理变量相关联所需的大型队列。其次，该平台配置为识别与肿瘤免疫微环境相关的约二十种细胞类型，包括腺癌细胞、腺上皮细胞、基质细胞、淋巴细胞、巨噬细胞以及CD8? T细胞亚群（如CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞）。

直肠癌中的CD103?CD8? T细胞：可重复的深度学习量化与分区特异性预后关联

T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞已成为肿瘤免疫学的重要焦点，代表在肿瘤组织内建立持久驻留并介导快速局部抗肿瘤反应的细胞群体。CD103?CD8? T细胞代表细胞毒性T淋巴细胞的一个独特T_RM样亚群，浸润肿瘤组织并通过E-钙黏蛋白介导的相互作用与上皮细胞结合。CD103整合素（αE链）与上皮肿瘤细胞上的E-钙黏蛋白结合，将这些T细胞锚定在与靶细胞的直接接触中。这一结构特征将CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞与再循环T细胞区分开来，并支持其作为局部抗肿瘤效应细胞的拟议作用。

在包括结直肠癌在内的多种实体瘤中，CD103?CD8? T细胞的丰度与患者预后改善相关。CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞的积累也与黑色素瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌中免疫检查点阻断的良好反应相关，标志着该亚群是候选的空间免疫生物标志物。与非恶性组织中的组织驻留记忆T细胞类似，其效应功能和组织驻留被认为在由基质细胞和基质细胞因子线索塑造的局部微环境内得以维持，将T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞的生物学置于T细胞、肿瘤上皮和基质区室之间固有的三方关系中。

尽管有这些生物学动机，将CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞分析整合到直肠癌的新辅助放化疗（NACRT）反应预测和器官保留决策中仍 largely 未被探索。Cu-Cyto能可靠地识别免疫组织化学染色的直肠癌标本中的CD103?CD8? T细胞。两位病理医师独立审查了Cu-Cyto在额外直肠癌标本上的细胞类型分类，并达成了一致评估，支持这些密度测量的可重复性，这是AI衍生生物标志物被采纳的先决条件。

在接受新辅助放化疗（NACRT）治疗的局部晚期直肠癌中，基质CD103?CD8? T细胞密度在多变量分析中被确定为无复发生存期的独立预测因子，而同一细胞群体的肿瘤内密度未显示显著的预后关联。这种分区特异性的预后价值差异无法仅用细胞计数解释，表明预后信息存在于CD103?CD8? T细胞的空间定位中，这推动了下文引入的区内空间框架。这种分区特异性模式与原发性乳腺癌不同，在乳腺癌中肿瘤内而非基质CD103?CD8? T细胞可预测无复发生存期，提示具有预后信息的区室可能因癌症类型和治疗背景而异。

共定位指数

分区感知密度在直肠癌中提供了预后信息，但未捕捉区内细胞的空间排列。共定位指数（Co-Localization Index, CLI）将深度学习衍生的分类概率和细胞坐标转化为定义组织区域内两种细胞群体空间共定位的单一定量指标。

在预定义区域内（全切片可视化中该区域被操作化为280 × 280像素的图像块），CLI对来自两个群体的每一对细胞贡献的加权和进行求和。权重取决于两个因素。首先，CLI将两个细胞的分类概率相乘（p_i × p_j），因此不确定的识别贡献较小。与传统数字病理学为每个细胞分配单一标签不同，现代深度学习分类器为每个候选细胞类型返回概率。其次，权重按两个细胞之间距离的平方反比（1/r2）缩放，因此远距离配对贡献可忽略不计。

直观上，当两个群体的许多高置信度细胞彼此靠近时，CLI升高；当它们稀疏、不确定或相距较远时，CLI下降，从而将细胞的几何邻近性转化为单一可比较的数值。

当两个具有相同免疫细胞密度的组织在空间排列上存在差异时，CLI的价值变得具体。在一种组织中，CD8? T细胞与肿瘤细胞混合，与潜在靶标直接接触；在另一种组织中，等量的CD8? T细胞形成与肿瘤细胞空间分离的独立簇。仅密度将这两种情况视为等效，但生物学后果不同。CLI以单一数值捕捉这种差异，允许对这类构型变异进行定量检验。

上述定义的CLI在两种细胞群体之间运作。然而，许多具有生物学意义的相互作用涉及同一局部区域内的三种细胞群体。CLI框架可自然扩展至这种情况：每个三元组（分别来自三个群体中的一个细胞）在三个细胞被高置信度识别且彼此接近时贡献较大项。结果是捕捉超出双群体CLI可描述范围的三细胞构型的单一数值；同一原理在理论上可扩展至四个或更多细胞群体。

在此框架基础上，研究人员通过训练Cu-Cyto分类器识别CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞，将CLI扩展到直肠癌。近期研究表明T_RM样状态由抗原反应性和周围微环境局部指定，将分析问题从细胞丰度转向局部背景。三细胞CLI直接捕捉这一转变：它将CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞、肿瘤和基质成分之间的空间关系提取为单一定量参数，从而能够系统量化肿瘤免疫微环境中的此类三细胞相互作用。

在全切片水平，CLI对每个280 × 280像素的图像块进行计算并映射到整个组织，产生可测量相互作用强度的图像块水平分布。无需施加最小细胞计数阈值即可为每个图像块分配CLI值：如果相关细胞群体之一缺失，则求和为空，CLI值为零。正的二细胞CLI要求两个群体各至少有一个细胞，而正的三细胞CLI要求三个群体各至少有一个细胞。这一特性使CLI非常适合全切片映射。对每个图像块计算CLI可揭示单个标本内的不均匀相互作用：一些区域显示密集的肿瘤-免疫接合，而其他区域显示可测量的相互作用很少。这一视角支持全切片预后和免疫架构的详细映射。

当前应用与未来方向

在临床肿瘤学的AI生物标志物格局中，Cu-Cyto和CLI占据独特位置。Immunoscore已确立区室感知细胞密度作为结直肠癌可重复的预后生物标志物，但密度丢弃了免疫-肿瘤相互作用发生的空间架构。全图像AI方法捕捉全局纹理模式，但缺乏细胞身份和空间分辨率。Cu-Cyto识别具有解剖坐标的单个细胞，CLI将这些坐标转化为两种或三种细胞类型之间空间相互作用的定量指标，这是密度指标和全图像AI单独均无法提供的轴。

由于Cu-Cyto基于标准明场免疫组织化学而非专用采集平台运行，它避免了CODEX、MIBI或Xenium等高多重空间方法的专用仪器和可观每标本成本，支持常规临床部署。这一比较涉及部署可行性而非分析性能：两者在工作流程的不同阶段运作且互补，高多重方法在同时标记密度和亚细胞分辨率方面保留优势。CLI在方法学上对底层成像平台不可知，原则上可应用于任何细胞水平技术衍生的坐标。

最直接的临床应用是新辅助放化疗（NACRT）后直肠癌的预后分层，正在考虑在扩展队列中验证CLI。正在研究的具体场景包括对NACRT完全缓解者进行观察等待器官保留的分层，以及识别最可能从辅助化疗中获益的患者。两种应用使用相同的Cu-Cyto-CLI框架，但在不同时间点取样。观察等待场景将CLI应用于NACRT前活检标本以预测持久完全缓解，因为成功缓解可能在治疗后组织中不留下可测量的肿瘤-免疫相互作用。辅助治疗场景将CLI应用于NACRT后切除标本，以标记尽管病理反应良好但复发风险升高的患者。两个决策都依赖于在前瞻性随访队列中针对生存终点校准CLI阈值。

肿瘤学中的临床AI正朝着两阶段流程发展：一个阶段从原始数据中提取结构化生物学信息，下游阶段使用该信息进行临床预测。Cu-Cyto提取细胞及其位置，CLI从中推导空间相互作用指标。它们共同构成此类流程的第一阶段。将空间特征转化为相关临床预测的匹配下游模块仍有待在NACRT后直肠癌中开发。

当前证据基础存在若干注意事项：Cu-Cyto的分类准确度因细胞类型而异，CD103?CD8? T_RM样肿瘤浸润淋巴细胞发现源于单机构分析，有待多中心验证，CLI的平方反比距离加权代表几种生物学上合理的公式之一。位模式核滤波算法说明了这种权衡：尽管它抑制多重计数，但物理上重叠的不同细胞偶尔可能被合并而计数不足，这是基于网格的细胞测定固有的局限。在全切片水平，CLI在固定图像块平铺上映射以用于可视化，因此两个细胞落在不同图像块中的相互作用在两个图像块中均不被计数。每个可视化图像块的周边边缘被排除在图像块水平计算之外以限制边界效应，但这些尚未被正式量化。如果跨图像块相互作用是主要关注点，CLI可改为在更大感兴趣区域或使用重叠/滑动窗口计算。实际采用将需要在具有不同染色方案和扫描仪的多机构中进行分析验证、临床效用的前瞻性证据，以及将空间读数整合到仍针对切片水平解读优化的病理工作流程中。