用于博来霉素基电化疗的定制双极电极在卵内及离体患者来源葡萄膜黑色素瘤中的研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Custom bipolar electrode for bleomycin-based electrochemotherapy in patient-derived uveal melanoma in ovo and ex vivo

　　

引言：葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma，UM）是一种罕见肿瘤，是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤。尽管局部肿瘤控制率高，但转移性疾病仍常见，系统治疗选择有限。电化疗（Electrochemotherapy，ECT）联用博来霉素通过电穿孔（Electroporation，EP）增强细胞内药物摄取，从而提高靶向抗肿瘤活性。本研究探讨使用定制双极电极递送博来霉素基ECT在UM患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft，PDX）中的作用。 方法：研究人员在卵内（in ovo）与离体（ex vivo）实验体系中分析UM PDX。肿瘤移植物接受750 V或1000 V的单独EP，或联用1 μg/mL或2.5 μg/mL博来霉素的ECT。进行组织学评估和免疫荧光分析，以评估肿瘤形态、黑色素瘤相关标志物表达、血管化、增殖活性及治疗诱导的细胞死亡通路。 结果：ECT较未处理对照引起明显肿瘤破坏和肿瘤大小参数下降；卵内模型中，750 V单独EP或联用2.5 μg/mL博来霉素后肿瘤面积显著减少，750 V各EP组肿瘤周长均显著减少，而离体模型变化无统计学显著性。黑色素瘤相关标志物包括黑色素瘤标志物组合和Sox10在治疗后下降，卵内多个条件及离体部分条件有显著差异。细胞死亡标志物提示多种机制参与，卵内模型中凋亡、焦亡、坏死和坏死性凋亡标志物出现统计学显著变化，离体中gasdermin D表达未达显著。治疗反应因实验模型和EP条件而异，提示模型依赖性细胞响应。 讨论：使用定制双极电极的博来霉素基ECT在UM PDX的卵内和离体模型中均诱导显著肿瘤损伤。这些发现支持双极电极基ECT用于眼内肿瘤治疗的潜在应用，并为电极设计优化和转化研究提供依据。

论文解读：《Frontiers in Cell and Developmental Biology》刊载的这项研究中，葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma，UM）源于眼脉络膜、睫状体或虹膜黑素细胞恶性转化，是成人最常见原发性眼内恶性肿瘤。现有问题包括：局部治疗可控制原发灶，但约40%–50%患者仍发生转移，肝转移占90%以上；转移后中位总生存不足1年，系统治疗如化疗疗效有限，免疫治疗效果温和，tebentafusp仅适用于HLA-A*02:01阳性人群。因此，亟需具有转化潜力的新策略。电化疗（Electrochemotherapy，ECT）通过电穿孔（Electroporation，EP）提高博来霉素等化疗药 intracellular uptake，在多种肿瘤有效，但用于UM多停留于临床前，且眼内用电极设计优化几乎未被探索。研究人员据此设计可瘤内插入的定制同轴双极电极，在UM患者来源异种移植（Patient-Derived Xenograft，PDX）的卵内（in ovo）与离体（ex vivo）系统中评价其疗效与细胞死亡机制。

主要关键技术方法：样本来自2023年7月至2025年1月共12例UM患者摘除眼球的肿瘤组织，67份用于卵内、33份用于离体。定制双极电极由IGEA S. p.A.制造，同轴结构含远端导电极P1、绝缘间隔S、近端导电极P2及热缩套管；脉冲由Genedrive发生器施加，参数均为8个100 μs方波、5 Hz，电压取750 V或1000 V，博来霉素浓度取1 μg/mL或2.5 μg/mL。卵内将肿瘤碎片种植于鸡胚绒毛尿囊膜（Chorioallantoic Membrane，CAM）第7天、第14天治疗、第18天收样；离体为摘出后即刻处理。分析依靠H&E组织学、ImageJ量化肿瘤面积/周长/Feret直径，以及黑色素瘤标志物、Sox10、CD31、Ki-67、cleaved caspase-3、gasdermin D、HMGB1、RIP3免疫荧光。

研究结果：3.1 组织学评估显示，卵内未处理移植物结构紧凑、有中心坏死并与CAM整合；治疗后结构紊乱、边界不规则、坏死区扩大，750 V单独EP及联用2.5 μg/mL博来霉素时面积显著下降，所有750 V EP组周长显著下降；离体各组面积、周长、Feret直径下降但无显著性。3.2.1 肿瘤身份方面，卵内黑色素瘤标志物组合和Sox10在联用博来霉素时显著下降，750 V单独EP的Sox10变化不显著；离体中750 V+2.5 μg/mL博来霉素使黑色素瘤标志物显著下降，1000 V+2.5 μg/mL博来霉素使Sox10显著下降。3.2.2 血管与增殖方面，卵内CD31在750 V单独EP及所有1000 V组显著下降，Ki-67各组成像低且无显著差异；离体CD31变化不显著，Ki-67在对照最高且治疗后显著下降。3.2.3 凋亡方面，卵内750 V单独EP和1000 V+1 μg/mL博来霉素使cleaved caspase-3显著升高；离体两种单独EP及750 V+1 μg/mL、1000 V+2.5 μg/mL博来霉素均显著升高。3.2.4 焦亡方面，卵内除750 V单独EP外各治疗组gasdermin D显著升高；离体gasdermin D稀疏且无一达显著。3.2.5 坏死方面，卵内750 V单独EP及两种2.5 μg/mL博来霉素条件HMGB1显著升高；离体仅1000 V+2.5 μg/mL博来霉素显著升高且染色均质。3.2.6 坏死性凋亡方面，卵内750 V、1000 V单独EP及750 V+2.5 μg/mL博来霉素使RIP3显著升高；离体仅1000 V+1 μg/mL博来霉素显著升高。

讨论总结：研究人员指出，双极电极把阴阳极集成于单针，可减少针数、简化眼内定位，适合空间受限的眼内病变；卵内反应强于离体，归因于CAM血管支持和微环境。ECT不是单一死亡机制，而是凋亡、焦亡、坏死、坏死性凋亡重叠响应，HMGB1等提示潜在免疫原性细胞死亡，但CAM免疫不成熟、离体无动态免疫，故免疫后果不能充分评估。分析点为治疗后4天，博来霉素全效可能未被完全显现。局限包括卵内非哺乳宿主、窗口短，离体无血管生理支持；二者是互补的中间临床前系统，尚需合适动物模型验证。眼内转化可探索巩膜外电极、术中内镜切除时静脉用博来霉素加局部EP、或巨块型UM术前减瘤后放疗。

结论译文：本研究表明，使用定制双极电极的博来霉素基电化疗可在UM PDX中诱导肿瘤破坏与多模式细胞死亡。治疗降低了肿瘤大小参数和黑色素瘤相关标志物表达，同时提示多种细胞死亡通路参与。治疗效果在卵内设置中比离体肿瘤样本更明显，表明微环境依赖性响应。这些发现支持了用于UM的瘤内双极电极配置的电化疗的生物学活性和可行性。