Gentiana sino-ornata Balf. f.乙酸乙酯提取物缓解高脂饮食和四环素诱导的小鼠肝损伤：基于血清药物化学、网络药理学与实验验证的机制研究

《Frontiers in Pharmacology》：Gentiana sino-ornata Balf. f. ethyl acetate extract alleviates high-fat diet- and tetracycline-induced liver injury in mice: insights from serum pharmacochemistry, network pharmacology, and experimental validation

　　

背景：非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球最常见的慢性肝病之一，其相关的代谢功能障碍可能增加药物性肝损伤（DILI）的易感性。本研究旨在评估Gentiana sino-ornata Balf. f.乙酸乙酯提取物（GSEA）在高脂饮食（HFD）和四环素暴露小鼠中的肝保护作用。方法：在体外和体内评估了GSEA的抗氧化和抗炎活性。随后，采用超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）对GSEA的血中吸收成分进行表征，并结合网络药理学分析和分子对接阐明其肝保护作用的潜在机制。最后，在高脂饮食和四环素诱导的肝损伤小鼠模型中对预测机制进行了实验验证。结果：GSEA表现出显著的抗氧化和抗炎活性。初步鉴定出25种潜在具有生物活性的血中吸收成分，并预测磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/Forkhead盒蛋白O1（PI3K/Akt/FoxO1）信号通路为GSEA抗肝损伤的通路。分子对接进一步证明AKT1与多种主要成分（包括獐牙菜苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷）之间存在良好的结合相互作用。体内实验表明，GSEA通过抑制炎症和糖脂代谢相关基因的表达、减轻肝脏炎症、调节肠道微生物群以及部分调节PI3K/Akt/FoxO1信号通路，显著缓解了HFD和四环素诱导的肝损伤。结论：总之，这些发现为支持GSEA作为预防或治疗与代谢功能障碍和四环素暴露相关的肝损伤的天然治疗剂的潜在应用提供了机制证据。

一、研究背景与目的

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是全球最常见的慢性肝病之一，约影响全球25%的成年人口，长期高脂饮食（HFD）是其主要危险因素，可促进肝脏脂质蓄积、氧化应激和炎症反应。药物性肝损伤（DILI）是另一重要肝病类型，在中国年发病率约为23.8例/10万人。已有证据表明，NAFLD相关的代谢功能障碍可改变机体对DILI的易感性，四环素作为全球使用量最大的抗生素之一，在高脂饮食诱导的代谢紊乱背景下可能加重肝脏损伤。龙胆属（Gentiana）植物因富含环烯醚萜苷类成分而具有抗炎、抗氧化和代谢调节等药理活性，其代表成分龙胆苦苷和獐牙菜苦苷已被报道可改善NAFLD相关病理改变。然而Gentiana sino-ornata Balf. f.（GS）的化学物质基础及其肝保护特性尚未被系统阐明。该论文发表于《Frontiers in Pharmacology》，旨在通过血清药物化学、网络药理学与实验验证相结合的策略，系统评价GS乙酸乙酯提取物（GSEA）对HFD与四环素联合诱导肝损伤的保护作用及机制。

二、研究内容概述

研究人员制备了GS不同溶剂萃取部位，通过高效液相色谱（HPLC）定量分析确定乙酸乙酯部位（GSEA）富含目标萜类成分，并对其抗氧化、抗炎活性及肝保护作用进行了系统评价。

三、关键技术与方法

研究采用体外ABTS、DPPH和羟自由基清除实验评价GSEA的抗氧化活性；采用二甲苯致小鼠耳肿胀和卵清蛋白致足跖肿胀模型评价体内抗炎活性。运用UHPLC-HRMS血清药物化学技术鉴定口服GSEA后小鼠血清中的吸收成分；通过网络药理学（SwissTargetPrediction、STRING、Metascape等数据库）预测潜在靶点与信号通路，采用AutoDock Vina进行分子对接验证。实验验证阶段使用56只雄性昆明小鼠（购自成都达硕实验动物有限公司，SCXK（四川）2020-030），随机分为7组，建立HFD联合四环素诱导的肝损伤模型，通过苏木精-伊红（H&E）染色、血清生化指标检测、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）及16S rDNA肠道菌群测序等开展机制研究。

四、研究结果

（一）GSEA的抗氧化和抗炎活性
体外实验表明，GSEA在250 μg·mL^-1浓度下对ABTS自由基清除率达92.30%，与阳性对照维生素C（92.85%）相当；对DPPH自由基清除率为83.58%；羟自由基清除呈剂量依赖性（R²=0.995），5 mg·mL^-1时达67.13%。体内实验中，中、高剂量GSEA显著抑制二甲苯诱导的小鼠耳肿胀和卵清蛋白诱导的足跖肿胀，证实其具有明确的抗炎活性。

（二）GSEA的化学成分和血中吸收成分
UHPLC-HRMS共从GSEA中鉴定出36种化合物，包括9种黄酮类、6种萜类、2种异黄酮类、5种脂肪酰基类、3种苯丙素类及11种其他化合物。经口服给药后血清药物化学分析，确认其中25种为吸收入血成分，獐牙菜苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷和龙胆苦苷为主要血中吸收的活性萜类成分。

（三）GSEA抗NAFLD的网络药理学分析
通过靶点预测共获得207个潜在靶点，与NAFLD疾病靶点取交集获得90个共同靶点，蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析显示核心节点为AKT1、TNF和TP53。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析表明，PI3K-Akt信号通路为关键通路。分子对接显示4种主要萜类成分与AKT1的结合能均低于-5 kcal·mol^-1，其中马钱苷酸结合能最低（-6.2 kcal·mol^-1），提示其具有良好结合亲和力。

（四）GSEA减轻小鼠肝损伤和脂肪蓄积
H&E染色显示模型组小鼠肝脏出现明显细胞质空泡化、肝索紊乱等病理改变，肝体指数显著升高（P<0.01），血清ALT、AST、TG、MDA及肝脏TC、TG水平均显著高于对照组（P<0.01）。中、高剂量GSEA治疗可显著降低上述指标，改善肝脏病理损伤，其中高剂量组效果最为显著，表明GSEA可有效减轻HFD和四环素诱导的肝损伤及肝脏脂质蓄积。

（五）GSEA减轻炎症反应和糖脂代谢紊乱
qRT-PCR结果显示，模型组肝脏促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α及糖脂代谢相关基因FOXO1、G6Pase、PEPCK1的mRNA表达水平显著上调（P<0.01），GSEA各剂量组可不同程度下调上述基因表达。Western blot结果显示模型组p-Akt/Akt比值较对照组显著降低（P<0.05），GSEA治疗后该比值在数值上有所改善