基于空间光调制器的双光子多焦点显微镜中的同步多区域像差校正

《Advanced Photonics Nexus》：Simultaneous multiregion aberration correction in spatial light modulator-based two-photon multifocal microscopy

　　

双光子多焦显微技术（TPMM）通过并行激发实现了更快的成像速度，但厚组织中的像差会降低图像质量，且在不同视场（FOV）区域之间往往存在差异。我们提出了一种基于空间光调制器（SLM）的双光子多焦显微技术中同时进行多区域像差校正的单SLM框架。该工作流包含三个步骤：多区域像差感知、激发路径校正和发射路径校正。对于激发校正，我们采用了一种像差迭代与结构优化的Gerchberg–Saxton（GS）策略，在保持多焦均匀性的同时，将各区域特定的像差嵌入到全息图优化中。对于发射校正，我们通过在每个激发焦点周围足够大的区域内积分荧光信号，来重建每个扫描位置的图像，从而在不增加复杂硬件的情况下消除探测路径的像差。我们在嵌入小鼠脑组织中的荧光微珠以及厚度超过100 μm的土豆组织上验证了该方法，使用60×/1.2 NA水浸物镜校正了16个区域（每个区域41 μm×41 μm）。与传统等效双光子显微成像相比，完全校正后信噪比提高了7.8倍，横向分辨率提高了1.3倍，并在多个区域呈现出更清晰的结构。该方法提供了一种灵活的大视场双光子多焦显微成像方案，且光学装置相对简单。

1. 引言

双光子显微技术（TPM）能够在生物组织中进行体积成像，并广泛应用于神经科学和生物学研究。1 双光子多焦显微技术（TPMM）通过多个焦点并行扫描加速了TPM，大幅提高了成像通量，支持高速体积成像。2,3 与传统TPM类似，TPMM在成像厚且不均匀的组织时也会受到光学像差的影响。自适应光学（AO）已被用于校正TPM中的像差，4–7 并可扩展至TPMM。例如，通过校正折射率不匹配引起的球差，已增强了TPMM的成像深度。8 此外，通过将双光子多焦激发与图像扫描显微技术和自适应光学相结合，已实现了深组织超分辨成像。9–11 然而，在这些方法中，校正仅在小区域内有效，导致视场受限。当对更大区域进行成像时，空间变化的折射率和散射会导致区域相关的像差，12 在使用高数值孔径物镜时，这种效应更加明显。因此，对于大视场TPMM，同时在多个区域校正像差是必要的。

TPMM中的同时多区域像差校正涉及三个组成部分：(i) 感知多个区域的像差，(ii) 校正激发路径的像差，以及(iii) 校正发射路径的像差。一种先前的方法使用单个空间光调制器（SLM）在TPM中执行多区域像差校正，12 但它有两个实际局限性。首先，光学布局依赖于分束棱镜，这固定了可校正的子视场数量、几何形状和大小，限制了灵活性。其次，SLM被划分为不同区域的子孔径，降低了每个区域的有效调制孔径，从而降低了相位调制精度。在这里，我们使用单个SLM校正多个区域的像差，同时将完整的SLM孔径分配给每个区域的校正。相同的框架支持任意数量和大小的区域，无需棱镜定义的分束，从而实现更灵活的实施。

第一个要求是感知来自多个区域的波前畸变。使用多个波前传感器13,14 或宽场波前感知15 可以测量大视场的波前，并实现了实时多区域校正。然而，基于波前传感器的方案增加了硬件和对齐复杂性，并且对散射、信号水平和非常用路径误差敏感，这可能在厚组织实际成像中限制其稳健性。16,17 作为替代方法，无波前传感器自适应光学（WFSL-AO）为复杂样品提供了更简单且通常更稳健的配置。18 WFSL-AO的多区域感知通常通过基于优化的方法19–22（如随机平行梯度下降、遗传算法和模拟退火）或模态方法23–27 来实现。基于优化的方法通常需要逐个优化每个区域，使用单个自适应光学元件（AOE），这导致较长的校正时间和复杂的控制逻辑。相比之下，模态方法减少了所需测量次数23,24，并已被用于动态像差校正。26 在本工作中，我们采用模态方法来感知多个区域的像差，同时将测量次数保持在与单区域感知相当的水平。

非等晕反卷积可以利用在不同位置测量的相位信息来恢复高分辨率图像，28,29 但图像恢复质量强烈依赖于像差测量的准确性和前向模型的有效性。一种互补策略是通过迭代相位恢复过程，将测量的像差相位直接纳入全息图设计中。该概念已在并行激光扫描显微成像30、多光子全息投影31 和模式光激发32 中得到验证，实现了并行校正。在这里，我们开发了一种像差迭代与结构优化的Gerchberg–Saxton（AISOGS）算法，用于补偿TPMM中多个区域的激发路径像差。AISOGS将每个区域测量的像差嵌入迭代过程中，使区域特定的校正应用于相应的激发光束子集。还引入了两项额外改进。首先，我们结合了加权方案35 和权重优化33，在实现精确像差补偿的同时，保持整个视场的焦点强度均匀性。其次，我们在迭代过程中去除了不必要的相位旋转（参照文献34），加速了收敛。通过这些改进，算法在25次迭代内收敛，且每个区域的校正波前被应用于相应的激发光束。

在TPMM中，激发路径和发射路径都可能引入像差。仅进行激发路径校正是不够的，因为荧光发射在传播和探测过程中也可能被畸变。36,37 在传统TPM中，大面积点探测器（如光电倍增管（PMT））收集激发体积发出的几乎所有光子，使最终图像对探测路径像差基本不敏感。5,17,36 然而，在TPMM中，通常使用像素化面探测器（如sCMOS相机）并行记录信号，探测到的宽场图像可能被发射路径像差空间畸变。为此，我们实施了一种基于点探测相同原理的发射路径校正：对于每个激发焦点，我们在足够大的区域内积分探测到的荧光信号，以抑制探测路径像差对恢复强度的影响。然后将校正后的图像通过为对应的扫描位置分配积分强度，并在扫描过程中堆叠这些值来重建。

在本研究中，我们提出了一种单SLM的TPMM框架，能够实现多个区域的同时像差校正。提出的多区域校正包括三个过程：多区域像差感知、激发路径校正和发射路径校正。对于多区域感知，我们将多焦激发与模态无波前传感器方法相结合，并行估计多个区域的波前，从而快速检测区域特定的像差。对于激发路径校正，我们开发了AISOGS算法，并使用单个SLM同时校正多束激光的像差。与传统的像差迭代Gerchberg–Saxton（GS）算法相比，AISOGS提供了两项额外优势：在校正过程中保持视场间的亮度均匀性，并且在实现更高校正精度的同时收敛更快。对于发射路径校正，我们对与每个激发焦点对应的探测荧光信号在足够大的区域内进行积分，以抑制发射路径的像差。该实施使用sCMOS相机代替多个PMT，支持任意数量和大小视场的灵活校正。在生物样品上的实验验证表明，所提出的方法通过相对简单的光学装置实现了高效且灵活的多区域像差校正。

2. 系统与方法

2.1 具有同时多区域像差校正的双光子AO成像系统

具有同时校正多区域像差功能的双光子AO成像系统可以基于SLM在传统TPMM系统中实现，如图1所示。飞秒激光器（FL1-08, Light Conversion, Vilnius, Lithuania），中心波长为1030 nm，脉冲宽度小于120 fs，作为系统的激发光源。激光功率通过半波片（HWP, WPHSM05-1030, Thorlabs, Newton, New Jersey, United States）和偏振分束器（PBS, PBS1030, Thorlabs）调节。PBS后面的第二个HWP可将光束偏振方向对齐至SLM的工作轴（E19×12, 1920×1200, Meadowlark, Frederick, Colorado, United States）。伽利略望远镜由一块焦距为?25 mm的凹透镜（MCC10305-B, LBTEK）和一块焦距为200 mm的凸透镜（MCX10617-AB, LETEK, Shenzhen, China）组成，用于扩展激发光束。光束随后入射到SLM上，SLM用于生成多个焦点并同时校正多个区域的像差。一对焦距分别为300 mm（AC508-300-B, Thorlabs）和75 mm（AC508-75-B, Thorlabs）的接力透镜将SLM平面成像到振镜扫描器（S-8107M, Sunny Technology, Ningbo, China）上，扫描器孔径为3 mm。第二对接力透镜包含扫描透镜（LSM04-BB, Thorlabs）和管镜（TTL200MP, Thorlabs），将振镜扫描器成像到物镜（60×, 1.2 NA, 水浸, Olympus, Tokyo, Japan）的后焦平面上。光束由物镜聚焦到样品上产生双光子激发。物镜安装在压电物镜扫描器（PFM450E, Thorlabs）上，以便于聚焦样品的不同层。荧光沿原路返回，穿过同一物镜。最后，由二向色镜（DMLP900R, Thorlabs）反射的荧光通过探测管镜（TTL180-A, Thorlabs）被sCMOS相机（ORCA-FusionBT, Hamamatsu, Japan）收集。为过滤荧光信号，在发射路径上增加了截止波长分别为550 nm的长通滤光片（FELH0550, Thorlabs）和800 nm的短通滤光片（FESH0800, Thorlabs）。数据采集卡（DAQ, USB6211, NI）用于向振镜和相机发送两个同步信号。SLM和DAQ由LABVIEW控制。

图1 下载 全尺寸图像

具有同时多区域像差校正的双光子AO成像系统。

2.2 多区域波前感知的模态方法

在模态方法中，泽尼克多项式被广泛选为像差模式。38 将一系列具有不同已知幅度（偏差）泽尼克模式的相位加载到AOE上，以求解相应的泽尼克系数。在所提出的方法中，为了感知多个区域的波前，偏差像差需要与生成多个焦点（MFP）的相位叠加。对于每个叠加了MFP生成相位的偏差相位，都需要使用LABVIEW软件依次加载到SLM上，如图2(a)所示。当相位加载到SLM上时，sCMOS相机与振镜扫描启动同步开始曝光。2D扫描过程完成后，相机结束曝光并捕获图像。该过程通过DAQ实现，同步信号图如图2(b)所示。选择从第5到第16阶的泽尼克多项式，排除活塞、倾斜（tip）、倾斜（tilt）和离焦，作为要优化的泽尼克模式。由于像差测量需要4N+1次测量，共捕获49张图像。

为了感知多个区域的波前，相机捕获的每张图像被划分为多个区域以计算度量值。划分的区域数量与MFP数量一致。图像中的每个区域对应于样品上每个焦点扫描的面积。在实验中，我们使用4×4阵列，每个焦点扫描41 μm×41 μm的面积。该面积可以更大或更小，取决于样品中待校正像差的复杂性。图2(c)展示了焦点的扫描路径（黄色实线），并显示样品被分为16个区域以求解相应的泽尼克系数。与传统TPM类似，TPMM也可以选择最大双光子荧光信号作为度量。对于某一区域，度量可以表示为公式(1)：

$$M = \sum_{i=1}^{N_x} \sum_{j=1}^{N_y} I_{i,j}$$

其中 $I$ 表示图像强度。下标 $i$ 和 $j$ 是图像的像素坐标。$N_x$ 和 $N_y$ 是单区域中像素坐标的最大值。在完成每张图像各区域的度量计算后，使用高斯曲线拟合来求解相应的泽尼克系数。对于样品内的某一区域，我们对第5到第16阶泽尼克模式的每种模式总共使用五次评估。十二个泽尼克系数通过高斯拟合曲线依次求解。

各区域的波前可根据12个已求解的泽尼克系数构建。最终，通过该方法可同时测量16个像差波前。

**图2** 多区域波前传感的模态方法。(a) 产生多焦点光斑的相位与具有不同偏置的泽尼克模式相位叠加。所得相位依次通过LABVIEW软件加载到空间光调制器上。(b) 同步信号用于控制振镜和相机。(c) 左侧为多焦点光斑的扫描路径，右侧将图像分为16个区域以求解度。

## 2.3 激发光路中多区域的像差校正

在传统双光子自适应光学显微成像系统中，空间光调制器通常被编码以波前校正相位来减弱整个成像区域的光学像差。当区域内像差分布呈现非均匀性时，这可能导致区域内某些子区域的过度补偿。因此，利用单一空间光调制器同时校正多个区域的像差具有重要意义。1972年提出的GS算法旨在通过迭代傅里叶变换过程从给定的强度分布中恢复相位信息。39 傅里叶变换在GS算法中起着关键作用，因为它能准确模拟光在真实环境中的传播。通过GS算法校正像差的思想主要源于光学传播模型。在没有样本像差的情况下，光从空间光调制器平面传播到焦平面的过程仅由傅里叶变换描述。然而，当存在像差时，光不仅经历傅里叶变换过程，还会在到达焦平面之前穿过存在像差的介质。因此，如果将像差纳入GS算法的迭代过程中，理论上将被校正。类似地，对于多区域像差校正，通过将从不同区域获取的像差整合到GS算法的迭代框架中，可以有效地解决像差问题。

然而，GS算法是一种局部优化方法，很难准确收敛到目标值。这意味着校正相位难以精确求解，导致像差校正不足。加权Gerchberg–Saxton（WGS）算法通过实施加权策略，使结果稳健地收敛到期望值，是用于多区域像差校正的更好选择。在本文中，除了将像差校正过程放入WGS算法的迭代框架外，我们还对算法进行了两项改进以提高其效能和精度。该算法被命名为AISOGS算法，其程序流程图如图3所示。在算法中，入射光束的强度和相位分别为??(??)和Φ??(??)。下标??表示迭代次数。??表示空间域坐标（为简洁起见，我们仅讨论一维情况）。强度??(??)=1，对所有不同位置均如此。初始相位Φ1(??)由随机分布在0到2π之间的值组成。第??次迭代的复振幅（CA）可写为????(??)=√??(??)·exp(??·Φ??(??))。在传统WGS算法中，33 我们对空间域的复振幅进行傅里叶变换（FT）以获取频域的复振幅。在此，为了校正激发光束的像差，我们在进行FT之前将像差纳入迭代过程。在16个区域中测量到的像差表示为??1(??),??2(??),…,??16(??)。频域中每一点的复振幅可通过两个步骤获得。首先，将空间域的复振幅与16个由校正相位组成的复振幅（exp(-??·????(??), ??=1,2,…,16)）相乘，形成新的16个复振幅。然后，通过对每一点的新复振幅进行FT，可获得频域中16个焦点处的复振幅????(????), ??=1,2,…,16。??表示频域坐标。????(??)和Ψ??(??)分别为????(??)的振幅和相位。在算法中，保留相位，振幅替换为目标振幅Λ(??)与权重????(??)的乘积。Λ(??)为16个焦点的全一向量。

**图3** AISOGS算法。

权重的引入使得WGS算法能够创建在不同视场内具有良好均匀性的多焦点阵列。然而，实际中空间光调制器产生的多焦点光斑是非均匀的，主要是由于目标多焦点强度受到Sinc函数的调制。33 非均匀性表现为中心区域亮度较高而边缘强度较低，这限制了大视场成像。在这种情况下，非均匀性而非像差成为限制视场的主要因素。为了实现大视场成像，我们需要在校正像差的同时处理非均匀性。为了校正主要由Sinc函数调制引起的多焦点光斑不均匀性，我们在WGS算法的现有权重中添加了一个新因子。权重????(??)可以表示为公式(2)：

$$W_k(u_n) = \frac{\langle C_k(u)\rangle_{16}}{C_k(u_n)} \cdot W_{k-1}(u_n) \cdot T(u_n)$$

其中?????(??)???为16个焦点的平均振幅。??(????)为新增的权重。??(????)的计算方法如下：首先，使用传统WGS算法产生的多焦点光斑对均匀溶液成像，获得16个点的强度，记为??(??1), ??(??2),…,??(??16)。然后，我们将新增权重中一个多焦点光斑的权重设为1，即??(??1)=1（此处我们将第一个点的权重设为1）。最后，新增权重可计算为：??(????)=??(??1)/??(????)。权重的引入将导致生成随机目标振幅。该方法在同时补偿激发光束不均匀性的同时校正像差。

加权修正的WGS算法与传统WGS算法类似，能够使结果良好地收敛到目标值，这表明像差可以有效地应用于每个视场。然而，算法在后期迭代中收敛速度较慢，且目标多焦点光斑收敛后的非均匀性难以降至10??以下。非均匀性可计算为(1/16)·∑??[??(????)2-Λ(????)2·??(????)]。这将导致我们系统中像差校正速度缓慢且校正精度不理想。为了提高算法的像差校正速度和精度，我们采用了文献34中描述的方法，该方法旨在用更少的迭代次数产生大规模均匀光学焦点阵列。该方法的本质在于通过识别并去除迭代过程中不需要的相位旋转来加快收敛速度。对于4×4阵列，经过反复尝试和验证，我们发现保持20次迭代后的相位不变可获得相对最优的结果，即如果??>20，则Ψ??(??)=Ψ20(??)。最终，算法在25次迭代内完全收敛，运行时间为17秒，产生的多焦点光斑收敛后非均匀性低于10?12。该算法使用MATLAB（R2018b）在配备12个CPU（12代Intel(R) Core(TM) i7-12700 2.1 GHz）的计算机上实现。

频域中的新复振幅可写为????(??)=????(??)·Λ(??)·exp(??·Ψ??(??))。空间域中的过渡复振幅????(??), ??=1,2,…,16，可通过对频域中每个焦点的复振幅????(????)进行逆FT获得。空间域中每个焦点的复振幅分布????(??)可通过将????(??)与exp(??·????(??))相乘得到。空间域中的最终复振幅????(??)可通过叠加所有焦点的复振幅????(??)获得。保留????(??)的相位用于下一次迭代，丢弃振幅。重复该过程。经过25次迭代后，我们得到校正相位，该相位可校正激发光束在多区域的像差。

## 2.4 发射光路中多区域的像差校正

将校正相位加载到空间光调制器后，双光子显微镜的激发光束可被校正。然而，荧光在经历与激发光束相同的光路后，也会受到发射光路中像差的影响。在传统双光子自适应光学系统中，由于使用相对宽面积的PMT（光电倍增管）可以收集激发区域的所有荧光信号，因此只需对激发光束进行像差校正。使用大面积PMT还可以通过减轻散射效应来提高成像深度。40 为了校正发射光路中多区域的像差，我们需要在不同样品位置获取一系列图像并对它们进行后处理。为了便于图像采集，需要重新校准相机与振镜之间的同步。具体而言，每次振镜到达新位置时，sCMOS相机启动曝光并捕获相应的双光子图像（信号每个上升沿触发一次相机）。同步信号的示意图如图4(a)所示。图4(a)与图2(b)的对比表明，在图2(b)中，相机在振镜扫描过程中持续曝光，便于高速图像采集并最小化像差测量所需时间。相比之下，在图4(a)中，相机在振镜扫描的每个离散位置被触发。其目的是单独收集在每个特定激发点激发后样品发出的完整荧光信息。对于面积为41 μm×41 μm的子区域，所需扫描步数为80×80，相应的扫描步长为41/80 μm。因此，总共需要采集6400张图像。给定所选区域的相机帧速率为约120 Hz，相应的采集时间估计约为53.3秒。虽然速度稍慢，但它能够以简单的系统框架校正发射光路中的像差，并可实现任意数量和大小视场的多区域像差校正。每个激发焦点对应的探测区域面积为(41 μm×60 μm)×(41 μm×60 μm)（系统放大倍数为60），这足够大以收集单个激发焦点的所有双光子荧光信息。实际上，积分区域只需要比在像差影响下探测点扩散函数展开对应的区域更大即可。这意味着通过积分每个激发焦点对应的荧光信号，可以完全校正发射光路中的像差。对于每张采集的图像，在单个激发焦点扫描过的区域内对每个激发焦点对应的荧光信号进行积分（此处我们对所有像素点对应的强度求和），以消除发射光路中像差的影响。图4(b)展示了被多焦点光斑激发的样品特定位置的图像。图4(c)是图4(b)中白色虚线框的放大图。关于单个激发焦点的所有探测信息都包含在图4(c)的区域中。图4(d)代表图4(c)中每个像素对应强度值的总和。图4(d)中的白色部分（一个像素）代表求和结果。单个像素的位置在积分区域的中心。从图4(c)到图4(d)的过程即为发射光路中的像差校正过程。我们每张由sCMOS相机采集的图像获得16个总和。最终校正后的图像可通过在相应扫描位置叠加所有总和获得。

**图4** 发射光路中多区域的像差校正。(a) 发送至相机和振镜的同步信号示意图。(b) 多焦点光斑扫描一个位置时捕获的图像。(c) (b)中白色虚线框的放大图。(d) (c)中每个像素对应强度值的总和（比例尺：15 μm）。

## 2.5

样品制备
对于本实验，我们制备了两类样品：一类是将荧光微珠嵌入小鼠脑组织，另一类是商业购得的土豆切片（157 至 0481，Kenis 公司）。嵌入小鼠脑组织的荧光微珠样品制备方法如下：在本研究中，健康的 C57BL/6 小鼠饲养于 22°C±2°C 环境中，遵循 12 小时光照/12 小时黑暗循环，自由进食和饮水。小鼠在异氟烷麻醉后被安乐死。随后迅速取出大脑。大脑在 4°C 下浸入 4% 多聚甲醛（Biosharp 公司）中 24 小时，以确保彻底固定。之后，用 PBS 缓冲液（Labshark，中国湖南）清洗大脑三次。随后，使用振动切片机（VT1200S，Leica，德国 Wetzlar）沿矢状面将大脑切片为 150 μm 厚。为了使切片透明，我们使用了参考文献 41 中描述的超快光学透明化方法。透明切片被小心转移至共聚焦培养皿底部。将新鲜制备的荧光微珠 - 琼脂糖凝胶轻轻涂抹在脑切片的上表面，并使用移液器吸头均匀铺开。最后，凝胶在 4°C 冰箱中放置几分钟直至完全凝固，之后即可进行成像。荧光微珠 - 琼脂糖凝胶的制备方法包括以下步骤：称取适量的低熔点琼脂糖粉末（ST107，Beyotime，中国上海），加入蒸馏水配制 1%（wt/vol）琼脂糖水溶液。使用微波加热溶液直至琼脂糖完全溶解。然后，迅速加入适量的 1.0 μm 橙色荧光微珠（F13082，ThermoFisher，美国马萨诸塞州 Waltham），并充分混合，使最终微珠浓度达到 1×10? 个/ml。所有涉及动物的实验均已获得海南大学机构动物护理和使用委员会批准（批准号：HNUAUCC-2024-00101）。

3. 实验结果
3.1. 荧光微珠的像差校正
为了确认所提方法的有效性，我们最初对嵌入小鼠脑组织内的荧光微珠进行了像差校正。在对样品进行像差校正测试之前，已进行了系统像差校正。这是通过对薄切片成像，在 SLM 上施加一系列变化的相位，并计算相应的图像指标来获得最清晰的图像来实现的。校正后的波前相位最初叠加在多焦相位（MFP）的相位上。在随后的测量中，在对样品进行像差校正之前，必须将多焦相位（MFP）与系统像差校正相位叠加，表明随后的像差源于样品本身。在像差校正步骤中，首先采用模态法感知多个区域内的激发光束的波前。根据第 2.2 节描述的方法，在荧光微珠样品上测得的波前如图 5(a) 所示。波前的变化反映了样品在不同视场（FOV）中像差的变化，即使某些变化很细微。这种变化与样品本身的固有属性密切相关。随后，我们根据测得的波前，使用第 2.3 节中说明的 AISOGS 算法对样品进行了像差校正。算法运行约 17 秒后，获得校正后的激发光束相位。

图 5 下载全尺寸图像 荧光微珠的像差校正。
(a) 荧光微珠样品上 16 个区域测得的激发光束波前。
(b) 直接用 sCMOS 相机采集的图像。该图像受激发路径和发射路径像差的影响（无自适应光学，NO AO）。
(c) 通过积分每个激发焦点对应的信号获得的图像，这等效于校正发射路径中的像差（发射自适应光学）。
(d) 通过不仅校正激发路径中的像差，还校正发射路径中的像差获得的图像（全自适应光学）。
(e)–(g) 分别是面板 (b)–(d) 中黄色虚线框的放大图（比例尺：15 μm）。

通过将校正后的相位加载到 SLM 上可以校正激发光束的像差。发射路径中的像差可以按照第 2.4 节所述的方法进行校正。我们比较了像差未校正的情况、仅在发射光路中校正像差的情况（类似于传统 TPM）以及激发和发射光路中均校正像差的情况。图 5(b) 显示了直接使用 sCMOS 相机采集的图像。这意味着在激发路径和发射路径中均没有进行像差校正。在该图中，"NO AO"表示未对样品引起的像差进行校正，而在对实验样品成像之前，整体系统像差校正已经完成。背景太强，导致某些信号无法区分。

图 5(e) 是图 5(b) 中橙色虚线框包围区域的放大视图。图像中没有可分辨的荧光微珠。图 5(c) 显示了通过积分每个激发焦点在相应位置对应的信号获得的图像，这等效于校正发射路径中的像差。与图 5(b) 相比，信噪比（SNR）显著提高，信号变得更容易区分。图 5(f) 中的放大视图对应图 5(c) 中橙色虚线框包围的区域，表明之前无法区分的两颗荧光微珠现在已被分辨。图 5(d) 展示了所提方法的像差校正结果，表明激发路径和发射路径中的像差均得到了校正。像差校正后，信噪比进一步改善，更多的荧光微珠变得清晰可辨。图 5(g) 是图 5(d) 中橙色虚线框包围区域的放大视图。比较图 5(f) 和 5(g)，虽然荧光微珠在图 5(f) 中可辨认，但光斑尺寸较大表明分辨率较低。图 5(f) 中的结果也等效于使用传统 TPM 成像获得的结果。然而，像差校正后，如图 5(g) 所示，证明所提方法与传统 TPM 相比，信噪比提高了 7.8 倍，分辨率提高了 1.3 倍。结果证实了所提方法的性能。

3.2. 淀粉土豆的像差校正
为进一步证明所提方法的能力，我们对土豆切片进行了像差校正。切片的最大厚度超过 100 μm。土豆切片中的淀粉颗粒在双光子激发下表现出自体荧光。使用上述方法，我们对位于 100 μm 深度的淀粉颗粒在 16 个区域进行了像差校正。像差校正后，16 个区域的成像性能表现出不同程度的改善。图 6(a) 显示了使用配备 sCMOS 相机的常规双光子多焦显微镜（TPMM）采集的图像，表明在激发路径或发射路径中均未应用像差校正。由于激光光路的像差以及荧光光路的像差和散射，图像模糊。图 6(d) 代表图 6(a) 中白色虚线包围区域的放大视图。该区域对应于其中一个焦点扫描和成像的区域。我们可以看到图像的细节难以辨认。图 6(b) 显示了一张图像，这等效于校正发射路径中的像差。比较图 6(b) 与图 6(a)，样品细节在图 6(b) 中变得清晰可辨。此外，由于发射路径中散射的校正，一些噪声斑点被消除。图 6(e) 中展示的放大视图也证实了这一观察结果。图 6(c) 显示了通过不仅在激发路径中还在校正发射路径中 16 个区域的像差获得的图像。与图 6(b) 相比，由于激发路径中像差的校正，图 6(c) 中图像的信噪比和分辨率进一步提高。图 6(f) 中的放大视图也证实了这一观点。图 6(g) 是沿图 6(d)–6(f) 中绘制的虚线的强度轮廓图。在同时校正激发和发射路径中的像差后，图像显示出最高的对比度。实验证实，通过我们提出的方法校正激发和检测光路中的像差后，成像效果显著改善。

图 6 下载全尺寸图像 淀粉土豆的像差校正。
(a) 直接用 sCMOS 相机采集的图像（无自适应光学，NO AO）。
(b) 通过积分每个激发焦点对应的信号获得的图像，这等效于校正发射路径中的像差（发射自适应光学，Emission AO）。
(c) 通过不仅校正激发路径中的像差，还校正发射路径中的像差获得的图像（全自适应光学，Full AO）。
(d)–(f) 分别是面板 (a)–(c) 中白色虚线框的放大图。
(g) 沿面板 (d)–(f) 中绘制的虚线的强度轮廓图（比例尺：15 μm）。

4. 讨论与结论
我们提出了一种在基于 SLM 的双光子多焦显微镜（TPMM）系统中同时进行多区域像差校正的方法。该校正通过三个相互关联的部分进行：多区域像差感知、激发路径校正和发射路径校正。对于像差感知，我们将模态无波前传感器方法与多焦激发相结合，能够在多个视场中快速并行估计区域特定像差。对于激发路径校正，我们开发了一种改进的 GS 算法，称为 AISOGS，以将测得的波前应用于其对应的视场。除了像差补偿外，AISOGS 还解决了视场间的激发不均匀性，并提供快速收敛和改进的收敛精度。对于发射路径校正，我们遵循类似于传统 TPM 的原则：通过在一个足够大的面积上积分与每个激发焦点相关的荧光信号，有效地抑制发射路径像差的影响。这种策略避免了添加复杂硬件，并支持对任意数量和大小视场的灵活校正。事实上，点的数量也受到激光功率和点间距的限制。多区域像差校正的双光子多焦显微镜（TPMM）实现了在复杂、异质组织中的大视场、高质量成像，这拓宽了双光子显微镜的实际应用范围。所提出的框架设计灵活且相对易于实施，使其适用于多种成像条件。一个剩余的限制是成像速度，特别是发射路径校正阶段。提高速度的一个可能途径是用光电倍增管（PMT）阵列替换 sCMOS 相机，但这会增加系统复杂性，降低灵活性并提高成本。同时，改进的计算机硬件（以及进一步的代码优化）可以减少激发路径校正中相位求解的运行时间。随着这些进展，我们期望所提方法能够在更具挑战性的生物组织支持大视场成像，同时保持高度的灵活性和稳健的像差校正。