聚焦脑肿瘤：手术室中拉曼光谱学的综述

《Journal of Biomedical Optics》：Shining a light on brain tumors: a review of Raman spectroscopy in the operating room

　　

脑瘤手术的比较工作流程。当前标准做法（上图）显示从手术到完整分子诊断之间存在较长时间的延迟（长达4至9周），术中决策仅限于通过冷冻切片进行形态学评估。在拉曼增强工作流程（下图）中，通过手持光纤探头从切除腔获取的光谱由经过训练的算法分配到肿瘤或正常组织类别，结果在约2秒内返回。基于机器学习的分子改变预测（<90秒）和风险分层的决策作为潜在的未来能力加以展示，目前仍处于研究阶段。沙漏图标指示所选阶段的时间需求。由BioRender创作。501. 临床背景与未满足的需求1.1. 脑瘤的负担全球每年有超过30万人被诊断为脑及其他中枢神经系统（CNS）癌症，死亡率持续偏高。1 原发脑及CNS恶性肿瘤的五年终疗率仅为36%。2 肿瘤可能包围或弥散于功能性健康脑组织中。神经外科医生必须在最大程度减少控制关键功能的健康脑组织损伤的同时，最大限度切除肿瘤以降低复发风险。分子标志物的诊断也可通过定制化癌症治疗改善预后，3 然而获取这些信息目前需要耗时的实验室流程，可能延迟治疗决策。脑转移瘤起源于非脑部器官，通过血脑屏障经血行播散。约15%至20%的癌症患者会出现脑转移瘤，4,5 其发病率在每10万人中8.3至14.3例之间，且似乎呈上升趋势。6 这一上升趋势反映了神经影像学检测的改善以及全身性癌症治疗的进步延长了生存期，从而增加了脑转移发生的时间窗口。6,7 脑转移瘤的预后因患者和肿瘤因素而异，从3个月到46个月不等。8胶质瘤是最常见的原发恶性CNS肿瘤，在美国的发病率为每10万人中5.8例。9 胶质瘤是一个广泛的肿瘤组群，根据2021年中枢神经系统世界卫生组织（WHO）分类，目前分为成人型、儿童型和围界星形胶质细胞瘤。10 基于组织学和分子标准的综合评估，胶质瘤在其所属肿瘤类型中被分配一个CNS WHO分级，肿瘤被分为低级别（CNS WHO 1级或2级）或高级别（CNS WHO 3级或4级）。更高级别指示更具侵袭性的生物学特征和更差的预后，CNS WHO分级旨在反映各肿瘤类型内的预期临床表现。101.2. 当前WHO分类与分子标志物胶质瘤的分类经历了一次根本性的范式转变，从纯粹基于微观外观的组织病理学标准转变为当前2021年CNS肿瘤WHO分类，后者将分子标志物整合为基本的诊断要素。10 这一演变认识到分子特征往往比单纯形态学更能准确预测临床行为。胶质瘤中最重要的分子标志物之一是异柠檬酸脱氢酶（IDH）1和2基因的突变，10 它们编码不同但相关的酶，催化相同的反应。11 IDH1/2突变是成人型胶质瘤分类为三个主要亚群的核心：胶质母细胞瘤（IDH野生型）、星形胶质细胞瘤（IDH突变型）和少突胶质细胞瘤（IDH突变型且1p/19q共同缺失）。成人型胶质瘤的分子分类具有重要的临床和治疗意义，使其准确评估成为最佳患者管理的关键。12胶质母细胞瘤现在被明确定义为IDH野生型，代表最常见且最具侵袭性的高级别胶质瘤，影响每10万人中2.9至5人。9,13,14 该肿瘤在所有原发脑瘤中具有最差的预后。尽管采用包括手术切除、放疗和替莫唑胺化疗在内的最大多模式治疗，中位生存期仍仅为约9至14个月。9,13,14除IDH状态外，其他分子标志物也会影响治疗及患者预后，例如O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）启动子甲基化状态。这是高级别胶质瘤中的一个关键预测性生物标志物，通过调节DNA修复酶表达来决定对替莫唑胺（一种烷化化疗药物）的反应。15 约40%至65%的高级别胶质瘤患者MGMT状态为未甲基化，赋予替莫唑胺治疗抵抗。15,16 CDKN2A/B纯合性缺失是另一个关键标志物。当出现在2级或3级IDH突变星形胶质细胞瘤中时，CDKN2A/B纯合性缺失将肿瘤升级为CNS WHO 4级，并与中位生存期减少超过55%相关，这改变了治疗方案。17其他重要的分子改变包括端粒酶逆转录酶（TERT）启动子突变、表皮生长因子受体（EGFR）扩增以及特定染色体改变，包括染色体7获得和染色体10缺失（chr +7/?10）。10 这些标志物进一步细化了分子分类和预后。1.2.1. 对手术决策的临床影响IDH突变型胶质瘤与更好的预后相关，部分原因是其对术后治疗（如放疗和化疗）的反应性。鉴于其改善的生存结果，外科医生可能倾向于在安全范围内尽可能多地切除肿瘤。更进一步，一些专业中心在可以不引起神经问题的情况下，考虑超边缘切除（切除MRI上看似异常以外的脑组织）。然而，支持常规使用这种更广泛切除方法的高质量证据仍然有限。18–20 相比之下，IDH野生型胶质母细胞瘤行为更具侵袭性，预后更差。21 对于这类肿瘤，当肿瘤位于或靠近控制重要功能（如语言或运动）的关键脑区时，外科医生可能会采取更谨慎的方法。然而，目前获取这些分子信息需要数天到数周。标准组织病理学评估结合免疫组化通常需要7至10天，22 甲基化阵列分析以及用于突变谱的全面二代测序可能需要4至9周，这是因为实际实施中的障碍。23,24 这种延迟限制了分子信息在术中决策中的实用性，可能导致次优的手术策略和治疗启动延迟。这些限制正是快速术中分子评估可以解决的问题。1.3. 当前工具的局限性神经外科医生在脑瘤手术管理中面临诸多挑战，主要是实现最大安全切除同时保护神经功能。他们还必须在导航复杂多变的神经解剖学的同时，应对肿瘤的生物学和结构异质性。这些手术复杂性又因目前依赖耗时的实验室分析来获取关键分子信息而加剧，从而造成术中决策的空白。为应对这些挑战，外科医生依靠一系列已确立的辅助手段：术前MRI用于规划和初步诊断；术中超声、术中MRI和荧光引导手术用于最大化切除；冷冻切片用于术中初步组织学诊断。每种手段都有与诊断精度、成本或工作流程中断、以及操作者依赖性判读相关的局限性。1.3.1. 术前MRI与神经导航MRI提供出色的解剖细节，仍是术前肿瘤诊断、手术规划以及通过立体定向神经导航进行术中指导的基石。其在神经外科肿瘤学中的作用有数十年的临床证据支持，25 但其已识别的局限性。术前MRI在组织表征方面存在局限。尽管患者的病史通常能在区分高级别胶质瘤和脑转移瘤时提供重要线索，但5%至15%的转移瘤在没有病史或其他器官肿瘤放射学证据的情况下发生。26 对于这些孤立性颅内病变，标准MRI序列在区分转移瘤和高级别胶质瘤方面准确率<65%。27 添加先进技术可提高这一准确率；弥散加权成像和灌注序列分别达到80%和90%的准确率。28,29 通过整合多种MRI序列，机器学习可以帮助预测部分胶质瘤分子标志物。30 然而，这些先进技术需要额外的成像时间、专用软件和技术专长，且各机构间采集方案和分析方法的差异限制了可重复性。28,29,31,32 MRI也无法检测细胞水平的肿瘤浸润，胶质母细胞瘤中的肿瘤组织往往远超出对比增强区域。33 这意味着外科医生无法识别可能导致早期复发的微观肿瘤浸润区域。MRI作为实时手术引导也存在局限。无框架立体定向导航是一种广泛用于手术规划和引导肿瘤切除的辅助手段。34 无框架系统注册到术前影像，因此随着大脑在手术过程中可能移位多达10至24毫米，其准确性会下降。这种移位源于脑脊液流失、肿瘤切除、患者体位变化和组织牵拉，因此导航位置不再与实际解剖匹配。35 这种渐进式不准确可能导致切除不完全或损伤健康组织。为应对这一问题，术中超声和术中MRI已被越来越多地采用。1.3.2. 术中超声与MR术中超声（iUS）以低成本提供肿瘤或切除腔的成像，易于整合入手术工作流程。其实时影像可用于克服脑移位并在某些导航立体定向系统中进行校正。36 一项2024年纳入随机试验的荟萃分析报告显示，与单独使用神经导航相比，iUS在高级别胶质瘤中全切除率更高。37,38 图像质量和判读高度依赖操作者，浸润性肿瘤和周围水肿可能表现相似，因此胶质瘤的弥散边界难以界定。36 与MRI类似，iUS报告的是组织结构而非分子身份。术中MRI（iMRI）也可以纠正脑移位以最大化切除范围。一项荟萃分析39 和随机对照试验40,41 报告显示全切除率改善，在合并随机数据中这对低级别胶质瘤有显著意义，但对高级别胶质瘤则不显著。39 然而，改善的切除率尚未转化为低级别胶质瘤已被证实的生存获益。41 虽然iMRI提供详细的体积评估，但受限于成本、基础设施需求、手术时间延长和手术工作流程中断。351.3.3. 荧光引导手术5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）荧光引导手术被胶质瘤指南推荐为高级别胶质瘤的辅助手段。25 肿瘤细胞将5-ALA代谢为原卟啉IX，在蓝紫光灯下荧光以识别可能切除的组织。42 在低级别胶质瘤中，其可靠性远低于高级别，因为这些肿瘤通常缺乏可见荧光。43 在常规实践中它通过视觉判断，尽管定量测量显示荧光形成从不可感知到强烈的连续谱而非明确的阳性或阴性，44 且它指示肿瘤存在而非分子亚型。荧光素钠也用于荧光引导手术。该物质长期以来在眼科用于视网膜血管造影，45 被超适应症用作高级别胶质瘤和其他对比增强病变（包括脑转移瘤）切除中的荧光造影剂。46 与5-ALA不同，它不被肿瘤细胞代谢，而是在血脑屏障受损处渗出，与MRI钆增强类似，提供术中对比增强区域的等效显示。45,47 其信号确实延伸到非增强组织，但大片浸润脑仍呈无荧光状态，因此无法界定完整的浸润边界。45 与5-ALA一样，它通过视觉判断且不提供分子亚型信息。1.3.4. 冷冻切片的挑战冷冻切片分析仍是宝贵的术中工具，提供可指导手术决策的组织学信息。它广泛可得，神经病理医生熟知其结果，且其结果直接指导已确立的手术决策。然而，冷冻切片在实时手术指导中具有已识别的局限性。虽然冷冻切片原则上可用于切缘评估，但组织消耗、每个样本超过20分钟的处理时间（包括组织制备、切片和染色）以及神经病理医生的可用性，造成手术决策延迟和麻醉时间延长。48 这使得广泛的切缘采样不切实际，特别是在关键功能区附近。快速冷冻过程引入伪影，包括冰晶形成、压缩和核细节模糊，可能损害诊断准确性，49 加之肿瘤异质性导致的采样误差。冷冻切片无法提供分子谱或突变分析，而这些信息在神经肿瘤学中影响诊断并指导治疗决策。这在外科医生术中可了解的信息与最终决定患者管理的分子信息之间留下了空白。1.3.5. 弥合诊断空白在缺乏实时术中诊断和分子洞察的情况下，外科医生通常必须采取以最大安全切除为重点的标准化方法，可能错失基于肿瘤生物学进行更精准干预的机会。拉曼光谱是一种基于激光的分子分析技术，可通过提供实时生化组织表征来弥合这些空白，从而指导定制化手术策略（图1）。图1. 脑瘤手术的比较工作流程。当前标准做法（上图）显示从手术到完整分子诊断之间存在较长时间的延迟（长达4至9周），术中决策仅限于通过冷冻切片进行形态学评估。在拉曼增强工作流程（下图）中，通过手持光纤探头从切除腔获取的光谱由经过训练的算法分配到肿瘤或正常组织类别，结果在约2秒内返回。基于机器学习的分子改变预测（<90秒）和风险分层的决策作为潜在的未来能力加以展示，目前仍处于研究阶段。沙漏图标指示所选阶段的时间需求。由BioRender创作。

沙漏图标表示所选阶段的时间需求。图片由 BioRender 制作。

**50** 本期刊此前的一篇综述文章回顾了截至 2020 年初拉曼光谱在神经外科领域的兴起。**51** 自该文章发表以来，该领域持续进步。活体手持式探头系统的多中心临床验证已完成，**52** 而基于 SRS 的平台已从组织分类推进到快速分子亚型鉴定和肿瘤浸润图谱绘制。**53,54** 拉曼光谱与 5-ALA 荧光引导手术之间的兼容性已得到证实，**55** 早期的离体自发拉曼光谱也开始从单一突变检测向更广泛的分子亚型鉴定扩展，但目前仅在少数队列中开展，外部验证有限。**56–58** 本综述综合了上述进展，评估了拉曼光谱作为术中工具的现有证据，将研究结果置于诊断证据等级框架中进行审视，并将该技术与现有及新兴替代方案进行比较。本综述的重点为胶质瘤和脑转移瘤，这两种是临床实践中最常见到的轴内脑肿瘤。其他肿瘤类型，包括脑膜瘤、垂体腺瘤和原发性中枢神经系统淋巴瘤，也是拉曼光谱的潜在应用目标，但不属于本文范围，尽管在这些疾病中开发的相关技术在有助于阐明拉曼光谱未来应用前景时会被引用。

## 2. 拉曼光谱：技术基础

### 2.1. 基本原理

拉曼光谱是一种基于激光的分析技术，用于探测生物样本的分子组成，目前已开发出多种形态作为脑组织分析的诊断工具。**51** 该技术已应用于不同器官、**52** 组织**59** 或细胞。**60** 当激光与组织相互作用时，大部分入射光子被反射、吸收或发生弹性（瑞利）散射而不产生能量转移。仅有小部分光子发生非弹性（拉曼）散射。非弹性拉曼散射会改变分子的振动能量。在临床温度下，斯托克斯散射（光子失去能量）占主导；反斯托克斯散射（光子获得能量）较弱，临床中极少使用。入射光子与散射光子之间的波长偏移取决于所涉及的原子和化学键，从而提供了一种分子标识物。**61**

拉曼光谱图以拉曼位移（以波数 cm?1 表示）为横轴、强度为纵轴。每个峰对应一种特定的分子振动。**62** 这些峰共同构成"分子指纹"，可在不使用试剂且不破坏组织的情况下识别组织成分。在复杂的生物样本中，相似分子的光谱可能重叠，带来分析挑战。然而，蛋白、脂质和核酸等分子家族可通过其特征光谱峰加以区分，从而支持对组织分子组成的半定量比较。这种"光谱指纹"方法已在多个部位支持癌症检测，包括肺，**63** 乳腺，**64,65** 和前列腺。**66,67** 这些应用为评估拉曼光谱在神经外科领域的应用提供了依据。

### 2.1.1. 技术变体

最常用的是自发拉曼光谱，使用单一单色连续波激光照射样本，无需预处理。非弹性散射光由分光计收集并衍射到探测器上，通常为电荷耦合器件（CCD）。所得光谱特征与化学计量或机器学习分类器配合使用以表征组织，深度学习方法现已广泛用于此环节。

相干拉曼技术——相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和受激拉曼散射（SRS）——使用两束同步激光调谐至特定振动频率。相干激发可将信号放大数个数量级，远高于自发拉曼，并支持无标记的显微分辨率成像。这使得 CARS 和 SRS 非常适合离体组织成像，但代价是仪器更为复杂。**68,69**

此外，还开发了两种增强机制。共振拉曼散射使用与目标分子电子吸收带调谐的激发波长，将其拉曼信号放大 102 至 10? 倍，从而能够检测内源性发色团。**70** 发色团选择性取决于激发波长，可见光（532 nm）激发，即可见共振拉曼（VRR），可增强类胡萝卜素波段。**70,71** 表面增强拉曼散射（SERS）利用等离子体金或银纳米结构放大金属表面的局部电磁场，使吸附分子的拉曼信号增强 10? 至 101? 倍，从而实现痕量级检测。**72**

### 2.2. 脑组织中的分子生物标志物

#### 2.2.1. 脑肿瘤的拉曼生物标志物

脑组织独特的拉曼光谱特征反映了其复杂的分子组成，其中来自氨基酸、脂质、核酸和蛋白质的特定光谱特征可区分肿瘤与正常脑组织，并与肿瘤级别和分子亚型相关。**73,74** 通过预测算法分析，这些光谱特征可基于分子特征对肿瘤进行分类。

在胶质瘤和转移瘤中，与正常脑组织相比，拉曼光谱通常表现为蛋白/苯丙氨酸波段升高，同时脂质相关峰降低。**59,70,75** 这些特征反映了肿瘤组织相对于正常脑组织的细胞密度增高、细胞外基质重塑以及髓鞘（脂质）含量降低，相关发现已得到质谱和红外光谱的佐证。**76,77** 在临床转化方面，这些光谱生物标志物使术中拉曼系统能够通过区分浸润性胶质瘤"高蛋白、低脂质"的特征与正常脑实质来检测手术切缘的残留肿瘤。**75**

拉曼标志物还与肿瘤级别相关。与低级别相比，高级别胶质瘤在 VRR 下表现出蛋白二级结构从 α-螺旋向 β-折叠的转变，色氨酸信号升高但在胶质母细胞瘤中又因凋亡和坏死导致色氨酸含量减少而回落，**70** 同时核酸信号增强，与 DNA 更新增加一致。**78** 高波数区域的脂质-蛋白强度比从正常脑组织到低级别和高级别胶质瘤呈进行性下降。**70,78**

#### 2.2.2. 突变和甲基化的分子特征

拉曼光谱并不直接检测基因突变或表观遗传修饰；它检测的是与特定遗传改变相关的下游生化变化。例如，IDH 突变型胶质瘤会蓄积致癌代谢物 D-2-羟基戊二酸。最一致的光谱发现是核酸（DNA）信号增加，**58,79** 伴随胶原减少。**57** 脂质和胆固醇变化的一致性较差：部分研究报告 IDH 突变肿瘤中脂质降低，**57,79** 而另一些研究则报告在新鲜组织和甲醛固定组织中胆固醇酯信号均升高，且后者已证实并非福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）处理的人工伪像。**56,58**

MGMT 启动子甲基化状态与无标记拉曼显微光谱可检测到的特征性脂质谱相关。未甲基化（替莫唑胺耐药）的胶质瘤表现出脂质氧化/外排上调和脂质合成通路下调。**80** 表 1 中其余标志物（1p/19q 共缺失以及探索性的 TERT、EGFR、CDKN2A/B 和 7/10 号染色体改变）仅来自单一探头式拉曼研究中深度学习显著性分析得出的暂定波段归属，但缺乏外部验证，且这些波段并非标志物特异性的。**57**

综上所述，拉曼光谱可检测从整体蛋白和脂质差异到突变相关代谢谱的分子特征（表 1）。这些特征支持两种潜在的神经外科应用：用于手术引导的组织鉴别，依赖较大的蛋白和脂质差异；以及分子表征，依赖遗传改变的更微妙相关物。由于该分子表征是间接的，其可靠性取决于生化-遗传关联的强度和一致性。这些标志物的临床表现在第 3 节中进行考察。

**表 1** 胶质瘤分子标志物及其贡献性拉曼特征

| 分子标志物 | 相关肿瘤类型 | 相关生化变化 | 已报告的贡献性拉曼特征（cm?1）? | 证据状态 |
|---|---|---|---|---|
| IDH1/2 突变 | IDH 突变型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤 | DNA 信号增加；D-2-羟基戊二酸下游磷脂谱改变和胶原减少；脂质和胆固醇变化有报告但方向不一致 | ↑ DNA ～498/826/1093；**79** ～1342 至 1376，**58** ↑ 磷脂酰肌醇 ～577，↑ 磷脂 ～1078，↓ 胶原 ～1448；**57** 胆固醇酯波段 ～419 至 430 和 ～532 报告升高 **56,58** | 验证最充分；离体约 87%–91% **57,58,79** |
| MGMT 启动子甲基化 | 胶质母细胞瘤 | 脂质小体胆固醇酯蓄积（甲基化时更高）；脂质外排基因下调 | ↑ 胆固醇酯 ～702 & ～1742；**80** ↑ 蛋白 ～951/1560，↓ 脂肪酸 ～1442 **57** | 初步；外部验证时性能下降；**57** 单中心机制性支持 **80** |
| 1p/19q 共缺失 | 少突胶质细胞瘤 | 氨基酸和核酸光谱差异；也可通过 SRH/AI 检测 | ↑ 氨基酸（丝氨酸/半胱氨酸）～524，↑ 核酸 ～1085 **57** | 外部验证后保持；约 85%–94% **53,57** |
| ATRX 丢失 | 星形细胞瘤 | 无直接分子相关物；通过 AI 分类的组织架构 SRH 特征 | 无标志物特异性波段（SRH 形态学；SRS 2845/2930 通道非特异性） | ～91%（SRH + AI）**53** |
| TERT、EGFR、CDKN2A/B、chr+7/?10 | 典型见于 GBM；TERT 也见于少突胶质细胞瘤，CDKN2A/B 丢失见于星形细胞瘤 | 轻微蛋白/脂质差异；生化基础尚未确立 | 无经验证的峰（仅分类器加权） | 探索性；外部验证时性能下降 **57** |

? ↑/↓ 表示各波段与标志物的关联方向（升高或降低），来自分类器显著性 **57** 或丰度/鉴别分析；**56,80** 显示方向而非定量。所列波段为贡献性特征，并非经验证的独立生物标志物；分类依赖于全谱机器学习，而非单一波段。～702/～1742 cm?1 的胆固醇酯波段来自胶质母细胞瘤的 MGMT 研究。**80** 2845/2930 cm?1 的 SRS 通道是所有基于 SRS/SRH 检测的共同通道，并非标志物特异性。**53**

## 3. 临床实施平台

鉴于非破坏性分子传感的潜力，研究人员自 2000 年代初起便开始评估拉曼光谱在神经肿瘤学中的临床应用。**81** 拉曼光谱融入临床工作流程主要有两种方式（图 2）。离体系统分析体外组织样本，这些样本包括用于即时诊断引导的新鲜手术活检以及用于研究和验证研究的存档标本（FFPE 或新鲜冷冻）。活体系统必须在手术过程中实时运行，在数秒内获取数据，以实现不间断的手术引导。大多数拉曼光谱研究是在离体活检上进行的，但活体领域也取得了重要进展。

**图 2** 拉曼光谱在神经肿瘤学中离体和活体手术应用。**(a)** 离体 SRS 显微镜（橙色背景）可在 90 秒内提供组织学质量的分子分析。**(b)–(d)** 活体应用（蓝色背景）使术中实时组织检测成为可能：**(b)** 手持光纤探头用于开颅术中的切缘评估（每次测量约 2 秒）；**(c)** 集成拉曼引导的活检针，用于沿针路径进行采样前的组织表征；**(d)** 内窥镜拉曼用于狭窄手术通道（如经鼻入路），是轴内肿瘤手术的未来方向。图 (b)–(d) 产生肿瘤与正常组织的分类结果。图片由 BioRender 制作。**82**

### 3.1. 离体系统

在离体环境中，已描述了许多拉曼方法。以下讨论三种方法：自发拉曼（显微镜和光纤探头配置）、基于 SRS 的相干拉曼成像，以及 VRR；第四种方法 SERS 作为新兴方向简要提及。自发拉曼（探头和显微镜）、SRS 和 VRR 平台的分类准确率在表 2 中进行比较。

**表 2** 神经肿瘤术中拉曼光谱平台比较

| 特征 | 自发拉曼（探头） | 拉曼显微镜（离体） | SRS | VRR（探头，可见共振） |
|---|---|---|---|---|
| 采集模式 | 活体或离体，单点 | 离体，逐点扫描成像 | 离体，宽场成像 | 离体，单点（手术室旁） |
| 采集时间 | 每点 0.2–2 秒 **75** | 每个切片数分钟至数小时 | 每个样本 10–90 秒 **53,54** | 每个光谱 1–5 秒 **71** |
| 空间分辨率 | ～0.5 mm（探头光斑） | 1–2 μm | ～1 μm | ～0.5 mm（探头光斑） |
| 激光配置 | 单连续波激光（785–1064 nm） | 单连续波激光（532–1064 nm） | 双脉冲激光（同步） | 单连续波激光（532 nm） |
| 光纤兼容 | 是 | 不适用（台式） | 否（自由空间光学） | 是（手持） |
| 样本制备 | 无 | 切除组织（薄切片或表面） | 切除组织，新鲜，约 10 秒准备 | 无（切除组织） |
| 肿瘤与正常脑组织检测准确率 | 活体：Sens/spec >95%（转移瘤、脑膜瘤）；约 85%–91%（GBM） | ～97%（新鲜）；**59** GBM 敏感性 90%–100%，在正常组织（FFPE）上表现较弱 **83** | 胶质瘤：AUROC >90% **54** | 准确率 >80% **71** |
| 分子标志物检测 | 离体：IDH、1p/19q、MGMT 及其他（初步）**57** | IDH（～87%–91%），1p/19q（初步），MGMT（初步）**58,80,84** | 深度胶质瘤准确率：IDH（～95%）、ATRX（～91%）、1p/19q（～94%）**53** | 尚未证实 |
| 荧光干扰 | 显著；近红外缓解 | 中等；近红外缓解 | 极小（固有抑制） | 较高（可见 532 nm 激发） |
| 监管状态 | 加拿大卫生部调查性检测授权 | 仅限研究使用 | 仅限研究使用 | 仅限研究 |
| 证据级别 | 前瞻性多中心分析验证（活体）**52** | 单中心分析验证（离体） | 前瞻性多中心分析验证（离体）**53,54** | 临床队列分析验证（离体，手术室旁）**70,71** |

缩写：CW，连续波；NIR，近红外；SRS，受激拉曼散射；IDH，异柠檬酸脱氢酶；ATRX，α-地中海贫血/智力障碍 X 连锁；MGMT，O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶；GBM，胶质母细胞瘤；Sens，敏感性；Spec，特异性。第 3.1.4 节讨论的基于 SERS 的术中方法仍处于动物模型单研究概念验证阶段，已有离体人组织验证，未纳入本平台比较。

### 3.1.1. 自发拉曼显微镜

离体拉曼系统已从早期的技术验证研究发展到术中临床应用。它们在手术中提供快速、互补的分子信息，而非替代常规分子诊断。通过在切除后数分钟内分析新鲜组织样本，离体系统可能为手术决策和治疗规划提供信息。

已开发了多种离体方法，其中拉曼显微镜代表最成熟的平台。拉曼显微镜将常规显微镜光学与拉曼光谱结合，提供组织切片的（1–2 μm）高分辨率分子成像。

这些系统能够区分特定的细胞类型85，绘制肿瘤边缘和浸润模式86，并分类生物流体液滴以用于液体活检应用87。然而，它们需要薄组织切片或表面测量，并且由于采样体积较小，从活检中采集测量数据可能需要数分钟到数小时。使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）离体脑活检的早期验证研究显示出可喜的结果，在区分胶质母细胞瘤、脑转移瘤和正常脑组织时，敏感性和特异性均超过85%83。然而，众所周知FFPE组织处理可能影响光谱质量并降低预测准确性88。这是因为福尔马林和石蜡各自具有独特的拉曼光谱特征89,90。福尔马林会在蛋白质、糖蛋白、核酸和多糖之间诱导交联，而这些交联在原生组织中是不存在的91。尽管存在这些挑战，当无法获得新鲜组织时，FFPE组织分析对于回顾性研究和生物标志物发现仍然具有重要价值。

新鲜组织分析已成为离体拉曼光谱的首选方法，因为它能够在没有处理伪影的情况下保留原生分子特征。使用离体新鲜组织样本的研究显示出比FFPE样本更高的准确性84,88。在这类研究中，新鲜切除的组织会在切除后立即进行分析。与FFPE切片相比，这种方法能更准确地代表术中生化条件。使用新鲜组织的研究报告称，在区分肿瘤与非肿瘤组织方面的准确性超过88%，在区分脑转移瘤与胶质瘤方面约为90%59,92。这些准确性支持了离体拉曼在术中组织分类中的潜力，但仍需前瞻性结果数据的支持。

在实践中，该文献中的"新鲜组织"既包括真正的新鲜标本，也包括解冻后分析的速冻标本。在脑肿瘤组织中的直接配对比较显示，冷冻固定导致整体光谱强度出现大部分可逆的降低，但不改变峰间关系88，基于自发拉曼的组织学（SRH）分析在新鲜样本和解冻样本之间保持相当的可靠性93。然而，冰损伤区域的冻结伪影可能使分类器准确性降低约20%94，并且始终观察到"新鲜组织 > 新鲜冷冻 > FFPE"的分类性能等级差异84,88。

除了肿瘤与非正常组织和肿瘤类型分类之外，离体研究还探讨了自发拉曼是否能够根据基因突变对胶质瘤进行亚分类。这些研究主要使用新鲜或冷冻标本，而非FFPE组织。其中，异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变检测的证据基础最为充分，独立研究组报告的准确性约为87%至91%（表1）57,58,79,84。

进一步的工作探讨了拉曼光谱是否能够检测其他具有重要临床意义的胶质瘤突变相关的下游分子变化。一项针对44名患者的研究专注于利用深度学习辅助的拉曼光谱检测七个分子亚组（IDH、1p/19q、MGMT、TERT、EGFR、染色体+7/?10和CDKN2A/B纯合缺失）。在这七个亚组任务中，模型的敏感性达到83.3%，特异性达到85.0%57。然而，外部验证揭示了局限性，仅对IDH和1p/19q保持准确性，而对其他标志物的性能有所下降。部分分子亚组性能下降的原因被归咎于数据不平衡、亚组不稳定以及生化变化微弱；解决这些问题需要更大、更多样化的数据集。

### 3.1.2 相干拉曼散射（SRS）成像

相干拉曼散射显微镜（CARS和SRS）能够在手术期间对新鲜脑组织进行快速、无标记的组织学评估。它们可用于检测并可视化富含脂质的结构（如髓鞘），因为其对CH?振动模式有强烈响应95,96。它们还可用于通过分析特定振动共振来分析蛋白与脂质的比率及分布96,97。这些生化细节支持了它们在术中引导和神经病理学中的潜在应用。同一个研究小组开发了三种基于SRH的系统。这些系统使用新鲜切除的组织，因此尽管它们用于术中，但属于离体技术，基于这些系统建立的分子分类平台仍处于研究阶段。

**DeepGlioma** 是一个结合SRS成像与人工智能进行肿瘤分类的分子诊断平台53。该系统在两个拉曼位移（2845和2930 cm?1）下采集SRS图像，以捕获脂质和蛋白质含量，生成类似虚拟苏木精-伊红（H&E）的图像。在标注图像上训练的深度学习算法分析这些图像以预测分子改变。从组织放置到分子分类的整个过程大约需要90秒。

在153名患者中的临床验证显示出高精度：区分IDH野生型与IDH突变型胶质瘤的准确性>95%，检测少突胶质细胞瘤中1p/19q共缺失的准确性>94%，识别星形细胞瘤中α-地中海贫血/精神迟钝X连锁（ATRX）缺失的准确性>91%53。该系统在手术期间提供近乎实时的分子分类能力，展现了SRS方法在此场景下的潜力。

**FastGlioma** 专注于快速边缘评估以检测残留肿瘤54。基于相同的SRS成像技术，FastGlioma强调术中决策的速度和简便性。切除腔内的新鲜组织样本会在切除后的10秒内成像，AI算法提供即时分类，对肿瘤浸润的受试者工作特征曲线下面积（AUROC）超过90%54。

在一篇近期发布但尚未进行同行评审的预印本中，Goff等人介绍了**SIGNAL**模型，这是一个具有2700万参数的SRH分类器，采用基于注意力机制的方法在分类前剔除含伪影的图像片段。SIGNAL在来自967名成人弥漫性胶质瘤患者的156万个视野上训练，报告了相较于DeepGlioma在IDH突变（93.5%对79.2%）、1p/19q共缺失（93.5%对88.3%）和ATRX缺失（89.6%对84.0%）方面提高了实际准确率，尽管片段保留率较低，但在边缘样本中仍保持了分类性能98。由于这些数据来自单一预印本，在独立验证前应视为初步结果。

DeepGlioma、FastGlioma和SIGNAL使用NIO激光成像系统（Invenio Imaging Inc.），这是一个具有国际多中心验证并已用于术中组织学的刺激拉曼组织学平台53,54。

这些系统针对不同的目标：DeepGlioma和SIGNAL都对分子标志物进行分类，其中SIGNAL是下一迭代版本，旨在对未加筛选的手术组织具有更强的鲁棒性，而FastGlioma针对的是在边缘快速检测肿瘤浸润。所有三个系统都共享一个值得审视的设计选择：它们只对存活的、有细胞结构的组织进行分类或绘制，并滤除血液、坏死和电灼损伤。对于读取分子亚型而言，这种过滤是合理的，因为信号来自完整的肿瘤细胞，丢弃无信息区域可防止错误分类。然而，被丢弃的组织并不总是对外科医生没有信息价值。坏死本身就是当前WHO中枢神经系统肿瘤分类中定义分级的特征10，而浸润边缘是手术决策最困难的区域。分子分类器也仅报告诊断三联体（IDH、1p/19q、ATRX），并未报告驱动分子分级的更广泛标志物，目前仅有一项研究尝试过，且外部验证尚未支持（见3.1.1节）。可靠的整个肿瘤及其边缘的引导最终将需要在此异质性上训练的模型，而不仅仅是基于最干净的样本。

### 3.1.3 可见共振拉曼（VRR）

Zhang及其同事报告了首次将便携式VRR分析仪（VRR-LRR）用于新鲜切除的胶质瘤组织，该分析在手术室相邻的房间进行，从52名患者的63个标本中采集了2220条光谱。他们基于主成分分析与支持向量机构建的分类器，对照组织病理学以超过80%的准确性区分胶质瘤与正常脑组织71。532 nm激发是否能在手术功率密度下安全地直接接触完整脑组织进行部署仍需评估。

### 3.1.4 表面增强拉曼散射（SERS）

2020年后的一种SERS方法在离体人胶质瘤组织中展示了原理验证，但其发展阶段与上述已建立的模态不同。该研究小组描述了一种智能SERS导航系统，通过感知肿瘤细胞代谢特征——代谢性酸中毒来界定切除边缘99。在切除边缘的组织上放置一小滴水滴，收集肿瘤微环境中的酸性代谢物，然后转移到患者体外的pH敏感SERS芯片上。芯片上的拉曼报告物产生pH依赖信号，深度学习模型将其转换为切除床的pH图。由于芯片在患者体外操作，无需施用外源性对比剂。在携带胶质瘤的大鼠中，该方法相比传统切除延长了总生存期，并且成功对人切除胶质瘤组织进行了pH映射，但尚未报告人体前瞻性临床评估100。

## 3.2 活体系统

活体拉曼光谱在手术期间实时探测组织，无需冷冻切片和离体方法所需的切除操作。

### 3.2.1 手持手术探头：实时引导

在活体拉曼实施方案中，手持式光纤探头通过多中心研究性试验获得了最广泛的临床验证。这些笔状、可灭菌设备内含被微型化至探头内部的光学元件。外科医生将探头尖端放置于脑组织上或靠近脑组织；系统照射该部位，收集拉曼散射光，并在数秒内返回组织分类结果52。

临床性能最初通过小型试验进行验证，随后扩展至更多的多中心试验。Jermyn等人的里程碑式研究涉及17名胶质瘤患者，在区分肿瘤与非肿瘤组织时，预测准确性、敏感性和特异性均超过90%。这包括检测被胶质瘤细胞浸润的正常脑组织这一关键能力，解决了磁共振成像和视觉检查的一项关键局限75。

随后一项使用可灭菌手持探头（Sentry）系统的大型多中心研究提供了进一步的临床证据，该系统已获得加拿大卫生部研究性检测授权。在这项涉及多机构67名患者的研究中，神经外科医生使用可灭菌手持探头在肿瘤切除过程中从各脑区采集拉曼光谱。单点系统从直径0.5毫米的斑点处收集散射光。采集的光谱根据拉曼信号质量进行评估，若质量达标则用于信息输入机器学习模型，该模型基于分子指纹对组织进行分类。系统与病理金标准对照验证，对脑转移瘤和脑膜瘤报告的敏感性和特异性超过95%，对胶质母细胞瘤约为85%至91%52。每次测量的采集和分类需要两秒，从而实现广泛采样而不干扰工作流程。这些准确性数据是在测量（每点）级别报告的，外科医生在切除过程中整合来自多次评估的信息以指导手术决策。

同一团队的后续研究识别了额外的肿瘤类型（IDH突变型星形细胞瘤、IDH突变型少突胶质细胞瘤和1p/19q共缺失型、室管膜瘤），并显示在同时进行5-氨基酮戊酸（5-ALA）荧光成像时拉曼性能保持不变，表明与现有手术辅助手段兼容55。

综合来看，这些研究描绘了一条从单中心原理验证到跨多机构和肿瘤类型的多中心验证路径；最新的工作也确认了探头可与5-ALA荧光配合使用。然而，仍存两项局限：该多中心活体探头研究来自单一协作团队（蒙特利尔和纽约），其向其他团队和仪器的推广性尚未得到证明；这些研究对肿瘤类型进行分类而非直接预测分子标志物状态。IDH状态检测仅在切除组织中验证（见3.1.1节），尚未通过原位探头实现。

### 3.2.2 与现有手术工具的整合

除手持探头外，同样的检测技术正在被集成到外科医生已使用的器械中，使拉曼从独立设备转变为嵌入式能力。两个方向已进入早期临床测试：集成拉曼光学元件的活检针和用于狭窄手术通道的内窥镜探头。

**活检针集成**将照明和收集光学元件直接整合在活检针内，允许在取样前于针尖处对组织进行探测。在3名患者中的临床测试显示，可在脑活检期间原位采集高质量拉曼光谱。这一原理验证表明其在提高诊断收益率、减少非诊断样本方面具有潜在作用，尽管在保持信号质量的同时微型化光学元件仍面临技术挑战101。

**内窥镜拉曼**沿两条技术路线发展。Leblond小组构建了一种卡式柄光纤拉曼探头，尺寸适用于鼻内通道（外径2.1 mm，长度11 cm），并在经蝶窦垂体腺瘤切除术中进行了原位测试，随后展示了基于拉曼的离体垂体腺瘤检测102。用于通过狭窄手术通道进行真正原位成像的柔性相干拉曼纤维内窥镜仍处于原理验证阶段103。两者尚未用于髓内肿瘤手术，但共同将内窥镜拉曼从概念演示推进至首次临床测试。未来在神经内窥镜肿瘤手术中的角色现在已不再仅是推测，而是合理的。

### 3.3 临床实施策略：平衡复杂性与能力

拉曼平台在技术复杂性与信息含量之间进行权衡（表2）。自发拉曼系统提供相对简单的配置，包括单激光源、直接的光学和稳健的光纤兼容性，使其适用于常规原位手术引导。

这些系统相对经济实惠，并在主动切除过程中提供即时反馈，全光谱采集能够实现全面的分子分析和生物标志物发现。然而，微弱的信号需要谨慎的荧光抑制策略，以及更长的采集时间来进行详细的图谱绘制。相干技术（CARS 和 SRS）提供增强的信号，能够实现视频速率成像和卓越的空间分辨率，用于详细的组织结构可视化。虽然它们更复杂且昂贵，但在需要详细分子信息时，它们能提供组织病理学质量的离体分析。高信噪比支持可靠的自动化分析，但这些优势需要复杂的双激光系统，具有精确的同步性，且目前与柔性光纤递送不兼容。未来的实施可能涉及结合两种技术协同作用的混合方法：体内拉曼引导初始切除并识别可疑区域，而离体 SRS 提供切除样本的详细分析，以确认边缘并确定分子亚型。进一步考虑的是神经外科医生如何解读每种系统的输出。DeepGlioma、FastGlioma 和 SIGNAL 生成神经外科医生或病理学家熟悉的虚拟 H&E 图像，并且 SIGNAL 还指示了其用于进行分类的区域。相比之下，光谱探头返回的是人类无法肉眼阅读的光谱特征标签，因此外科医生必须信任该分类，而不是亲自评估组织。弥补这一差距意味着要将区分性的光谱特征与临床医生已经熟悉的组织生物学特征相关联，并报告每次预测的置信度，或者当测量结果超出训练数据范围时发出警报。外科医生能够解读的输出，并带有不确定性度量，比不透明的标签更值得信赖。

4. 临床应用与影响
在评估术中诊断技术时，应考虑三个层次的证据：
• 分析有效性（该工具能否准确识别目标？）
• 临床效用（这些信息是否改变临床决策？）
• 结果获益（这些改变的决策是否改善生存率或功能？）
这一层级显示，准确性虽然是建立临床价值所必需的，但是不够的。104 目前，拉曼光谱在神经外科中的证据主要处于诊断准确性水平，早期的前瞻性数据表明，当与传统辅助手段结合使用时，它具有临床效用。105 尚未进行前瞻性随机试验来证明拉曼引导的手术能改善患者结局。这一区别对于定位以下讨论的发现很重要。

4.1. 手术引导与边缘检测
拉曼光谱最经证实的手术应用是在切除边缘对肿瘤和正常脑组织进行体内实时鉴别。这项能力直接解决了神经外科的挑战之一：在肿瘤边界与正常脑组织在视觉上无法区分时，实现最大程度的安全切除。这对于浸润性胶质瘤尤为重要，因为肿瘤细胞会远远超出可见异常的范围延伸。
自 Jermyn 等人，75 的概念验证研究以来，后续工作证明了体内拉曼光谱的易用性、工作流集成、速度以及跨肿瘤类型的适用性。52,55 潜在的手术用例是边缘评估：神经外科医生可以在切除腔的多个点上进行采样，在不破坏组织的情况下在两秒内从每个部位获取信息，克服了前述冰冻切片的几个局限性。然而，总边缘评估时间、最佳采样密度以及每位患者的点数尚未在文献中系统地报告，这代表了一个重要的临床转化证据空白。这适用于无法进行冰冻切片的部位，例如靠近功能区皮层的边缘，并且不会增加多少手术时间。
将拉曼光谱添加到神经外科医生的装备库中，有可能改善切除程度，这是其他术中工具（包括 5-ALA 荧光成像和术中超声及 MRI）共享的目标。35,106 有充分记录表明，增加切除程度可转化为胶质瘤的有意义生存获益，107 与次全切除术相比，胶质母细胞瘤的全切除术使患者一年生存率提高 61%，两年生存率提高 19%。108 然而，这些生存数据源自切除程度研究，而非拉曼引导的手术，该技术能否改善切除或生存尚待前瞻性证明。

4.1.1. 与 5-ALA 荧光引导手术的对比
5-ALA 荧光是胶质瘤手术中最成熟的术中光学辅助手段，也是唯一拥有一级结局数据的手段。一项 III 期随机对照试验显示，它在胶质母细胞瘤中改善了切除程度和无进展生存期，106 此后其使用已被广泛采用。因此，任何对拉曼光谱潜在角色的评估都必须与之同时考虑。
荧光素钠是许多中心使用的另一种荧光团，与 5-ALA 相比具有实际优势，包括成本更低、在麻醉诱导时给药以及无需术后光线防护。45,46 其证据基础不如前者确立，基于一项没有对照组的预后性多中心 II 期研究。47 没有随机结局数据可用。荧光素尚未与拉曼光谱直接比较，尽管已提出过两者的组合，45 因此随后的叙述性比较仅限于 5-ALA。
5-ALA 有公认的局限性。其荧光由外科医生主观评估，指示肿瘤存在，但缺乏区分肿瘤类型或检测特定突变的分子特异性。它还需要在手术前 2 至 4 小时口服给药，106 且在脑转移瘤中荧光不一致，在低级别胶质瘤中经常缺失。43,109 最近将受激拉曼组织学和荧光显微镜配对的工作表明，PpIX 优先积聚在肿瘤相关巨噬细胞中，尽管类星形胶质细胞恶性细胞也显示出增强的 PpIX，这引发了关于 5-ALA 荧光细胞基础的问题。110
拉曼光谱和 5-ALA 应被视为协同而非竞争的技术。两者可以并发使用，如第 3.2.1 节讨论的多中心探头研究所展示的那样。在一项关于切除边缘样本的离体比较中，拉曼光谱在切除边界检测残余肿瘤的敏感性高于 5-ALA 荧光。111 唯一一项直接比较两种模态术中应用的预后性临床试验发现，拉曼光谱在浸润区提供了更高的敏感性，而 5-ALA 提供了更高的特异性。它们的联合使用将检测准确率提高了约 10%，并与超出术前增强边界 52% 的切除体积增加相关。105 这种额外的切除是否改善了生存或功能并未进行评估。这些发现表明，拉曼光谱可以弥补 5-ALA 覆盖范围的空白，特别是在浸润性边缘、非荧光肿瘤亚型以及需要分子特异性的情况下。即便如此，5-ALA 仍然是验证最充分的术中辅助手段。

4.2. 分子诊断影响
关于自发拉曼和基于 SRH 的方法能够检测临床相关改变（IDH、1p/19q 和 MGMT 状态）的离体证据已在第 3.1 节中提出，并在表 1 中总结。这项工作来自几个独立机构，但仍处于初步阶段，外部验证有限，其能否为患者管理提供信息尚待证明。
术中检测这些改变的价值在于它所能实现的功能。除了提供诊断外，拉曼光谱还可能支持基于分子谱的术中肿瘤风险分层。这使得神经外科医生可以根据肿瘤生物学、相对于功能区的位置以及患者体能状态来调整手术方法。例如，如果未来研究验证了这一点，在 IDH 突变型星形胶质瘤中检测到 CDKN2A/B 纯合缺失可以提供与进一步切除的风险 - 获益评估相关的预后信息，因为这种缺失表明预后不良。然而，这一应用仍处于探索阶段。57
除了潜在的手术益处外，拉曼光谱可能有助于减少治疗延迟。如果该技术能够在术中提供快速的初步分子信息，它可以在等待确证性测序结果期间促进治疗计划，例如更早地识别靶向治疗（如 IDH 抑制剂）或临床试验的候选人。112 然而，这种加速的初步信息对治疗结局的临床影响尚未得到研究。
作为治疗计划辅助工具的拉曼光谱可能对脑转移瘤特别有用。研究表明，脑转移瘤与其原发肿瘤之间存在突变谱差异。113 然而，如果已经从原发肿瘤获得了突变谱，通常不会对脑转移瘤组织进行重复突变谱检测。如果得到验证，拉曼光谱可能潜在地检测与治疗抵抗性突变或原发肿瘤中不存在的新突变相关的光谱变化，尽管这一应用仍属推测，尚未在专门研究中进行调查。

4.3. 与替代技术的比较
4.3.1. 共聚焦激光内窥镜：实时光学组织学
共聚焦激光内窥镜（CLE）是拉曼光谱用于术中组织评估的最直接替代方案之一。该技术通常使用荧光对比剂和激光来产生组织细胞分辨率的实时数字图像，本质上是在手术期间提供“光学活检”。采用离体方法，CLE 在更短的时间内（13 分钟对 28 分钟）展示了比冰冻切片（89% 对 86%）更高的准确性。114 静脉注射荧光素的体内 CLE 也已得到证实，并且在直接比较中显示出比离体方法更高的敏感性。115
CLE 和拉曼光谱提供互补而非等同的信息：CLE 产生等效于组织学的形态学图像，而拉曼报告分子组成。两者都是非破坏性的，且每种都存在体内和离体实施方案，可在实时或近实时下成像。CLE 最常使用荧光素，尽管基于组织自发荧光的无标签 CLE 已得到证实，包括在脑肿瘤原位，116 而拉曼通常以无标签方式运行。在胶质瘤边缘，具有 CLE 经验的神经外科医生和神经病理学家显示出可比的诊断表现，尽管在这些浸润性区域中解释是主观的，且特异性有限，117 而拉曼分类是自动化的。55 获 FDA 批准的 CLE 系统已用于体内神经外科，118 而拉曼光谱仍处于研究性授权之下。

4.3.2. iKnife 质谱：破坏性但有信息量
iKnife 使用快速蒸发离子化质谱分析电刀切割期间的手术烟雾，在肿瘤切除过程中提供实时组织分类。Van Hese 等人，119 展示了对肿瘤和正常脑进行区分时 88% 的准确性，结果在组织气化后数秒内即可获得。该系统设计用于与标准电外科仪器集成，无需额外的手术步骤，而质谱的分子敏感性能够检测区分肿瘤类型的特定代谢物和脂质。
iKnife 的根本局限性在于其破坏性本质：组织必须被气化才能生成数据，这使得在关键结构附近进行评估成为不可能。相比之下，拉曼光谱的非破坏性评估能够在不损坏组织的情况下评估功能区，进行重复测量以确认，并进行全面的边缘评估（包括关键结构），所有这些都可以在组织切除之前完成。

4.3.3. 新兴分子方法
除了光学和光谱技术外，像牛津纳米孔长读长测序这样的快速测序平台显示出用于术中分子表征的前景，有可能在手术时间内提供确切的遗传信息。120 然而，这些方法仍处于研究阶段，验证主要局限于单中心研究。121 本节讨论的技术在速度、组织保存、分子深度和临床准备度之间的权衡上各占不同位置，最佳的术中工具箱可能结合几种互补的方法。

表3总结了这些术中技术与既定结构辅助手段（iMRI和iUS）的关键特征及当前证据水平。

**表3 术中脑肿瘤评估技术比较**

| 特征 | 拉曼光谱 | 荧光引导手术（5-ALA、荧光素） | 术中超声 | 术中MRI | CLE | REIMS（iKnife） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 组织保留 | 无损 | 无损 | 无损 | 无损 | 体内无损成像；体外亦有报道11? | 破坏性（汽化） |
| 结果时间 | 约2秒/点?2 | 实时（连续） | 实时（连续） | 20至60分钟/次扫描3?,?1 | 实时成像（约0.1秒/帧）；数分钟内解读11? | 数秒内11? |
| 空间覆盖 | 点采样 | 广视野（整个腔体） | 广视野（整个腔体） | 全脑（容积） | 小视野 | 点采样 |
| 分子信息 | 光谱指纹（体内）；新兴分子分类（IDH、1p/19q；仅限体外） | 仅荧光信号（无分子特异性） | 解剖学（残余肿瘤检测） | 解剖学（残余肿瘤检测） | 仅形态学（无分子信息） | 代谢物/脂质谱 |
| 所需试剂/药物 | 无需（无标记） | 口服5-ALA（术前2–4小时）或静脉注射荧光素（术中）?? | 无需 | 钆（可选） | 荧光素（静脉注射）；已验证无标记11? | 无需 |
| 操作依赖性 | 自动分类 | 主观视觉评估 | 高度依赖操作者采集与解读3? | 放射科医生与外科医生解读 | 经训练后可由神经外科医生解读；与神经病理科医生相当11? | 自动分类 |
| 低级别胶质瘤应用 | 有限的早期证据?? | 有限；5-ALA荧光摄取差?3，荧光素在非强化胶质瘤中呈斑片状?? | 可检测肿瘤主体；浸润边缘难以界定（水肿模拟肿瘤）3? | 提高全切除率3?,?1 | 已在低级别胶质瘤中证明可行性122 | 已在II级胶质瘤中证明分类能力11? |
| 工作流干扰 | 轻微（<5秒/次测量） | 轻微（与显微镜集成） | 轻微（成本低，易于集成，可重复） | 显著（需专用手术室，延长手术时间）3? | 原位成像轻微；离体（需活检）中度 | 轻微 |
| 证据水平 | 分析有效性（多中心）?2 | 5-ALA - III期RCT1??；荧光素 - II期前瞻性?? | 荟萃分析+RCT：高级别胶质瘤中切除程度更高3?,3? | RCT评估切除程度??,?1 | 前瞻性多中心初步研究11? | 单中心验证11? |
| 监管状态 | 加拿大卫生部调查性测试授权 | 5-ALA - FDA批准（Gleolan），EMA批准；荧光素 - 高级别胶质瘤超说明书使用?? | 已确立；广泛采用的临床辅助 | FDA批准，在专业中心实施 | FDA批准用于神经外科成像11?,11? | 仅限研究用途 |

缩写：CLE，共聚焦激光内窥镜；5-ALA，5-氨基乙酰丙酸；REIMS，快速蒸发电离质谱；RCT，随机对照试验；FDA，美国食品药品监督管理局；EMA，欧洲药品管理局；IV，静脉注射；HGG，高级别胶质瘤。

**5. 当前限制与技术挑战**

尽管所讨论的证据显示出前景，但在拉曼光谱成为常规术中工具之前，必须解决若干障碍。

**5.1 光谱采集挑战**

脑组织含有多种内源性荧光物质（包括NADH、黄素、脂质色素和卟啉）123，所产生的宽荧光背景可能远强于拉曼信号12?。这会掩盖组织区分和分子诊断所需的细微光谱峰，尤其在体内测量期间，切除表面的血液污染会进一步降低信号质量，尽管这可通过常规手术视野准备加以控制。选择近红外激发波长（785至1064 nm）可减少荧光产生，而计算技术（包括多项式基线校正、导数光谱学和小波变换）可在采集后分离拉曼信号12?,12?。

手术室照明构成额外挑战。手术显微镜照明和荧光顶灯会产生光谱伪影，必须予以消除。手术灯和神经导航红外源可通过将其方向偏离测量部位来管理12?。实践中，拉曼采集需要短暂（<5秒）停止显微镜照明并结合背景光谱减除??。该方案已整合入多中心研究工作流程，未造成显著手术干扰?2。

**5.2 机器学习模型泛化能力与数据集限制**

拉曼光谱的诊断准确性依赖于基于光谱数据集训练的机器学习模型。一项综述发现，按光谱层面划分数据的研究报告的准确性始终高于按患者层面划分的研究，且在多个案例中，独立测试集的表现显著低于交叉验证估计12?。迄今为止，所综述的少数研究在多种仪器上进行了训练或测试。使用一台光谱仪训练的模型可能难以转移至另一台，因为校准、强度和荧光存在差异。这引发了对过度拟合站点特异性光谱特征（源于仪器差异、组织处理方式或患者人口统计学差异）的担忧12?。唯一的多中心研究为Ember等人，其中报告了使用在一个中心训练的机器学习模型应用于另一个中心、由不同手术团队使用不同仪器所获测量的预测性能?2。Leblond等人测试了模型对未见肿瘤类型的泛化能力，星形细胞瘤的阳性预测值为70%，少突胶质细胞瘤为74%??。类别不平衡进一步降低了外部验证效果，如Liu等人所报告的少数分子标记物性能下降所示，详见第3.1.1节??。目前不存在公开的脑肿瘤拉曼光谱基准数据集，限制了跨组比较方法的能力12?。验证目标本身也在不断变化，因为WHO中枢神经系统肿瘤分类定期修订1?。基于早期标准训练的分类模型可能与当前诊断标准不匹配，需随分类更新进行重新验证。

**5.3 跨机构可重复性与标准化**

拉曼系统之间的硬件变异使跨机构可重复性复杂化。FDA评估发现，三种光纤拉曼设备的灵敏度范围为37至1590 counts/mW，结论是仅凭规格不足以预测体内性能12?。一项跨实验室研究比较了15个机构间的相同样本，结果显示峰位、强度和信噪比存在装置间变异，标准波数和强度校准仅部分减少这些差异12?。当前的拉曼校准标准——涵盖仪器性能（ASTM E1683）、波数校准（ASTM E1840）和光谱响应校正（ASTM E2911）——是为一般分析应用开发的，未完全满足生物医学体内需求12?。目前尚无术中拉曼采集的共识方案，尽管经多平台验证的开源预处理流程提供了部分解决方案13?。采样方案的标准化同样重要，因为当前研究报告的准确性为测量层面，而临床决策需要患者层面的诊断准确性及标准化的决策阈值12?。

这些可重复性问题因探头系统缺乏标准化而加剧。前述体内和体外探头研究在激发波长、光斑尺寸和接触几何形状（决定了每次测量采样的组织量）以及激光功率和积分时间方面存在差异。光谱及其附带的准确性数值无法在不同系统间转移，使不同组报告的性能数值难以直接比较。

**5.4 诊断错误的临床后果**

神经外科诊断错误的后果是不对称的，并因部位而异。靠近功能区皮层的假阳性（将正常脑组织报告为肿瘤）可能导致不必要的切除，造成永久性神经功能缺损。假阴性（将肿瘤报告为正常脑组织）则会使肿瘤残留，降低切除程度。

点状光谱学还引入了另一种具有挑战性的错误类型。由于探头采样离散点而非整个腔体，假阴性可能反映采样点遗漏与分类器错误同样多：残余肿瘤组织从未被采样。与广视野辅助手段（5-ALA或iUS）不同，拉曼目前无法映射整个边缘，可靠覆盖所需的采样密度尚未确定。这种稀疏采样在采集速度与漏诊风险之间形成权衡。

这些错误的临床影响取决于外科医生如何整合拉曼信息，以及它是作为独立决策工具还是作为既定术中方法的辅助手段使用。已发表研究未系统表征错误率12?或临床后果；需要前瞻性试验评估拉曼衍生信息如何改变手术决策和患者结局。

**5.5 监管途径与临床转化**

目前美国尚无用于脑肿瘤检测的拉曼诊断设备上市12?，且无先行设备意味着更严格的审批途径[例如De Novo或上市前批准而非510(k)]。分子诊断声明（IDH状态、1p/19q共缺失和MGMT甲基化）将比组织检测声明承担更高的监管负担，需达到与既定分子检测相当的临床有效性。5-ALA的FDA批准比欧洲批准晚了十年，说明了潜在的时间线挑战131。一种手持探头系统已获得加拿大卫生部调查性测试授权，正在进行多中心临床研究?2，但这仅代表监管过程的早期阶段。向常规临床使用的推进需满足监管证据标准的多机构试验。在现有手术基础设施内的成本效益也需正式评估，特别是在资源有限的环境。

**5.6 前进方向**

体内和自发拉曼工作的样本量仍然有限：最大的术中自发拉曼研究纳入了67名患者，体外自发拉曼分子研究主要涉及少于50例。基于SRH的成像研究规模较大（DeepGlioma验证中的153名患者，SIGNAL预印本中的967例训练集），但这些依赖于单一商业平台且为体外。早期独立原型开始出现，包括针对胶质母细胞瘤与冷冻切片对比测试的便携式全光谱SRS系统，但目前仅处于可行性水平132。已确定几项汇聚需求：大规模前瞻性试验，以生存或临床决策为终点；公开基准拉曼光谱数据集以实现标准化方法比较12?；以及针对既定辅助手段（包括5-ALA荧光引导手术、iUS和iMRI）的前瞻性随机对照研究。此外，组织处激光功率和辐照度等关键光学参数在各研究中报告不一致，少数明确引用安全标准（例如ANSI Z136和IEC 60825）。类似地，准确性指标常以点估计报告，置信区间和详细的队列人口统计学信息未一致提供。在这些差距得到解决之前，拉曼光谱仍应被视为调查性辅助手段，而非神经外科肿瘤学中常规临床使用的工具。

**6. 展望**

如果解决第5节概述的验证要求，拉曼光谱可从边缘检测辅助手段演变为在手术决策点提供实时生化信息的工具。与现有工具结合使用可支持风险分层切除和更早识别靶向治疗候选者，因为分子分类在临床管理中变得越来越核心。实现这一潜力需要前瞻性试验证明患者获益，而不仅是诊断准确性。在整个领域，临床转化领先于实施证据：诊断准确性研究甚至商业系统正在积累，而术中拉曼在神经外科中的卫生经济学论证和工作流整合依据仍很大程度上未被探索。