手术切除对头颈癌组织自发荧光寿命特征的影响：对术中肿瘤切缘评估的意义

《Journal of Biomedical Optics》：Effects of surgical resection on tissue autofluorescence lifetime signatures in head and neck cancer: implications for intraoperative tumor margin assessment

　　

FLIm仪器示意图及实验步骤。采用一台三倍频掺钕钇铝石榴石（Nd:YAG）微芯片激光器（STV-02E-140，TEEM photonics，法国Meylan）作为荧光激发光源，其重复频率为120 Hz，脉冲宽度为600 ps。荧光激发光和发射光通过一根芯径为365 μm的全硅多模光纤（FVP400440480，Polymicro）导入并导出目标组织。采用波长选择模块将荧光发射分离为三个非重叠光谱波段（CH1：390±20 nm，CH2：470±14 nm，CH3：542±25 nm，以及CH4：629±26.5 nm）。通过使发射脉冲依次通过三根长度不同的延迟光纤（FVP400440480，Polymicro），在时间上分离各光谱通道。采用单个微通道板光电倍增管（R3809U-50，Hamamatsu，日本）检测器探测时间复用信号。为对荧光发射进行时间分辨，由一台采样速率为12.5 Gs/s、8位分辨率的数字化仪（PXIe-5185，National Instruments，匈牙利Debrecen）记录来自MCP-PMT的电脉冲，该数字化仪具有1.5 GHz模拟带宽和80 ps时间分辨率，并与激光脉冲同步。采用一台445 nm连续波瞄准激光器指示FLIm点测量的位置。右图：FLIm测量首先在有体（in vivo）状态下从组织外表面获取。手术切除及标本转移后，在离体（ex vivo）状态下测量对应的外表面，有体与离体测量之间的平均间隔约为8分钟。缩写：FLIm，荧光寿命成像；Nd:YAG，掺钕钇铝石榴石；CH，通道；MCP-PMT，微通道板光电倍增管；DAQ，数据采集；UV，紫外。

1. 引言

手术，常与放疗或化疗联合，仍是多种实体恶性肿瘤（包括头颈部癌症）的主要根治性治疗手段。然而，确保彻底切除所有肿瘤细胞仍是一项重大临床挑战，手术切缘残留恶性细胞已被确认为局部复发和总生存率的明确预测因子。在头颈部区域，实现清晰的组织病理学切缘尤为困难，因为肿瘤常起源于关键解剖结构的邻近区域。近期证据表明，即使在初次手术后进行再切除，初次手术切除不充分仍与较高的复发率和较差的预后相关，这凸显了对可靠的术中切缘评估的迫切需求。

无标记成像技术的最新进展在体内外术中评估手术切缘方面展现了潜力。这些技术包括术中荧光引导手术、超声、光学相干断层扫描、光谱成像以及荧光寿命成像（FLIm）。在众多新兴无标记光学技术中，FLIm在活体内区分癌性与非癌性组织以及推进术中组织表征方面显示出强大的潜力。FLIm是一种能够识别增强代谢率的技术，而增强的代谢率常与癌细胞相关，并可促进低氧环境的形成。这些因素导致内源性荧光分子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD））的分子构型发生变化，从而提供与恶性（可能包括癌前）状态相关的代谢变化的重要信息。此外，FLIm还可测量的其他代谢相关因素包括肿瘤附近的血红蛋白氧合水平——随着肿瘤生长从血液中提取更多氧气而下降。此外，肿瘤环境中灌注不良导致代谢废物蓄积，降低局部pH值。细胞外基质变化，特别是癌变过程中胶原结构和交联的变化，也会导致自发荧光的变化，为FLIm用于组织表征提供了额外的对比信号。

在先前的研究中，我们证明了利用FLIm可以测量上述因素的变化，并已在术中活体环境中得到实施。然而，在体内获取的荧光寿命特征是否能够在离体条件下保持并可被可靠复现，目前仍不清楚。这一区分在临床上至关重要，因为术中决策依赖于体内成像，而验证和后续病理流程通常在离体标本上进行。本研究探讨组织切除后FLIm特征的变化，并阐明其在体内外肿瘤切缘评估中的潜在影响。

组织切除会引发快速的生化和代谢变化，如灌注丧失和低氧状态，这些变化可能影响荧光寿命测量。尽管离体对切除组织标本进行FLIm成像具有多项实际优势，但仍需进一步研究以确定在体内展现的敏感性和特异性能否可靠地在离体条件下复现。本研究旨在调查这些变化，并评估同一组织样本在体内与离体FLIm成像之间的差异。我们采用相量法分析荧光衰减数据，评估了75例患者口腔舌、扁桃体和舌根组织中正常组织与鳞状细胞癌及浸润性细胞癌的区分能力。我们采用基于相量的FLIm技术，对多个解剖部位进行配对的体内-离体分析，以量化组织切除后荧光寿命特征和诊断对比度的演变情况。尽管本研究所描述的最新数据主要涉及头颈部癌症领域，但相关方法和所获洞见具有通用性，可推广应用于其他组织和器官类型，从而拓宽FLIm在更广泛癌症类型中的应用范围。

2. 材料与方法

2.1 实验装置

本研究采用一台自定义设计的基于光纤的点扫描FLIm仪器进行数据采集。有关FLIm硬件和数据处理的详细信息可参阅我们此前的相关文献，FLIm系统的示意图如图1所示。简而言之，FLIm系统利用芯径为365 μm的多模光纤传输波长为355 nm的脉冲紫外激光激发光（600 ps，2 μJ），重复频率为120 Hz，在待检组织的小区域（约1 mm2）产生自发荧光。组织自发荧光由同一光纤探头收集，并通过二向色镜和带通滤波器分离为四个不同的光谱波段（CH1：390±20 nm，CH2：470±14 nm，CH3：542±25 nm，以及CH4：629±26.5 nm）。这些光谱波段对应胶原蛋白、NAD(P)H、FAD和卟啉的自发荧光发射峰值。这些光谱波段的选择旨在捕获与组织鉴别相关的关键代谢和结构荧光团。在本研究中，由于通道4的信噪比（SNR）较低，可能导致寿命估计的可靠性降低并增加结果的不确定性，因此将其从分析中排除。

图1

各光谱通道的光学信号被时间复用至单个微通道板光电倍增管（R3809U-50，Hamamatsu，日本）上，随后由高速数字化仪以80 ps间隔进行放大和时间分辨（PXIe-5185，National Instruments，美国德克萨斯州奥斯汀）。此外，采用一台445 nm连续波二极管激光器（TECBL50G-440-USB，World Star Tech，加拿大）标示FLIm点测量的位置。

FLIm数据在两种不同的手术场景中于术中获取：（1）经口机器人手术（TORS），采用da Vinci SP机器人系统（Intuitive Surgical, Inc.），通常用于口咽癌病例；（2）非TORS手术，即手工操作，通常用于口腔癌。在非TORS手术中，手持光纤探头（Omniguide Laser Handpiece）与内窥镜相机（Stryker）配合使用；在TORS手术中，光纤探头通过机器人器械操作，手术视野通过集成的da Vinci相机进行可视化。对于体内和离体测量，FLIm扫描均在组织上皮表面进行。根据手术场景，体内（标本切除前）和离体（切除后）成像的FLIm表面扫描各需约1至2分钟。对应的体内与离体测量之间的平均间隔约为8分钟。该间隔并非实验预先设定的，而是反映了典型的手术工作流程，包括标本切除、处理及转移至离体成像。为确保可比性，两次测量的成像条件进行了标准化，包括探头接触方式、角度和照明设置。

2.2 数据分析

FLIm数据采用此前报道的相量法进行分析。简言之，将衰减曲线的傅里叶变换的一次谐波绘制在二维图上，横轴为变换的实部，纵轴为变换的虚部。如图2所示，所有单指数衰减均落在一个半圆上，最短寿命位于坐标（1, 0），最长寿命映射在坐标（0, 0）处。相量图上的数据点与图像像素相关联；相量图中的每一点都可以追溯到图像中具有相同光谱或寿命属性的像素。此外，每个衰减曲线或光谱都映射到相量图上的唯一位置，相量的位置决定了寿命或光谱。相量图中的感兴趣区域可以反投影到与选定相量点相关联的像素上，从而实现快速便捷的图片分割。

图2

Re R(τ)与Im R(τ)的半圆图。曲线显示在ω = 2π/T时，τ/T从0.01到50的所有可能的单组份寿命。

此前已展示了相量法应用于具有不同时间门设置和采集周期的时域数据的情况。该理论框架可应用于不同的时间门配置。广义的相量半圆表达式为：

R(τ) = 1 / [cos(πK) - sin(πK)·coth(T / 2Kτ)·j]

其中K为采样点数，T为用于基于傅里叶变换的相量计算的数字化荧光衰减窗口，t为寿命。R为复数，参考半圆通过绘制R的虚部对实部生成。随着寿命增加，相量沿半圆从右向左移动。

在本实验操作中，T = 32 ns，K = 400。此处，T并不代表激光重复周期或总数据采集时长。荧光衰减波形以其原生80 ps采样间隔进行分析，未进行时间分箱。由于K较大且采样间隔相对于所测荧光寿命较短，有限采样相量曲线紧密近似于标准相量半圆。因此，采用了对应于K→∞极限的标准相量表达式，未施加有限门修正。当K→∞时，R收敛于标准相量曲线：

R(τ) = 1 / (1 - j·2πTτ)

图2展示了τ/T从0.01到5的修正参考半圆。平均寿命可通过以下公式估算：

τ = T·Im R(τ) / (2π·Re R(τ))

数据分析使用自定义MATLAB脚本完成，所有数据点均经过过滤处理以确保质量，采用30 dB信噪比阈值，任何信噪比低于此值的数据均被排除在分析之外，以确保可靠的寿命估计并排除低质量信号。

2.3 区分度指数

仅平均寿命可能无法完全捕捉荧光衰减多指数特性带来的差异，因此采用基于相量分布的区分度指数。

之前用于从双指数衰减曲线估算寿命值的一种分离度指数方法$^{29}$ 被改编用于本研究：??=|??1???2|/√var?(??1)+var?(??2)。将此方法扩展到其他量很容易实现，我们用它来通过测量云团的平均位置和方差来评估相位云团（phasor clouds）的可分离性。对于由 ??1 和 ??2 表示的两个相位云团，分离度指数计算如下：??=|mean?(??1)?mean?(??2)|/√var?(??1)+var?(??2)。图 3 展示了由泊松噪声生成的不同构型的合成相位云团及其对应的分离度指数。值得注意的是，可分离性不仅仅是两个云团距离远近的度量，它还考虑了云团的大小及其产生的重叠程度。
图 3
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具有相同均值但不同噪声水平（反映在云团形状中）的云团的分离度指数。

2.4. 患者队列与肿瘤类型描述
合格患者在 2016 年至 2021 年的五年期内被招募参与研究。该研究经加州大学戴维斯分校机构审查委员会（IRB）批准，并征得患者的知情同意。共有 90 名患者接受了 FLIm（荧光寿命成像显微术）检查。只有新诊断为口腔或口咽头颈癌（HNC）的术前患者被纳入本研究。FLIm 测量位置通过视觉标志与组织病理学相关联，仅包含对应关系可靠的区域。由于以下原因，15 名患者的 FLIm 数据被排除在分析之外。8 名患者的数据无法分析，原因是在手术过程中无法与组织组织病理学准确配准或存在仪器问题（例如软件故障或光纤探头损坏）。另外 7 名患者的肿瘤表现为黏膜受累极少至无黏膜受累（即肿瘤范围仅包括固有层或更深入的黏膜下层，详见局限性部分）。
因此，数据来自 ??=75 名具有不同解剖部位（表 1）的患者，用于分类器训练和测试。组织标签（癌性与非癌性）由专家病理学家根据组织病理学评估进行分配。每位患者贡献一个手术样本。大多数样本包含被归类为癌性或非癌性的区域，而部分样本仅包含一种组织类型，这是由组织病理学评估确定的。“其他”解剖标签包括舌腭沟、咽、口腔底、唇、磨牙后三角、牙龈、腭和会厌谷。在这些患者中，??=40 名患者表现为经免疫组织化学确认的 HPV 介导的口咽癌。其中 p16+ 用作 HPV 介导肿瘤的命名，p16- 用于不涉及 HPV 的肿瘤。

表 1
头颈癌患者中不同组织类型和解剖部位 FLIm 数据采集总结。按组织类型（癌性与非癌性）和解剖位置分组收集的活体和离体 FLIm 数据点数量。同时也指出为每个类别贡献数据的患者总数。每个样本的平均点数是通过将 FLIm 总点数除以相应类别中的样本数量计算得出的。

| 解剖部位 | 组织标签 | 患者数量 (N) | 活体 FLIm 点数 (n) | 平均活体点数/样本 | 离体 FLIm 点数 (n) | 平均离体点数/样本 |
| :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- |
| 腭扁桃体 | 癌性 | 27 | 22,874 | 847.2 | 24,454 | 905.7 |
| 腭扁桃体 | 非癌性 | 31 | 28,866 | 931.2 | 18,561 | 598.7 |
| 口腔舌 | 癌性 | 25 | 18,053 | 722.1 | 30,274 | 1211 |
| 口腔舌 | 非癌性 | 25 | 12,966 | 518.6 | 21,620 | 864.8 |
| 舌根 | 癌性 | 14 | 5797 | 414.1 | 9550 | 682.1 |
| 舌根 | 非癌性 | 19 | 22,170 | 1,166.8 | 10,971 | 577.4 |

3. 结果
3.1. 活体与离体 FLIm 测量评估（案例研究）
图 4 描绘了一名 68 岁男性患者切除前 [图 4(a)] 和切除后 [图 4(b)] 捕获的口腔舌白光图像。FLIm 测量数据点叠加在图像上，并根据癌性与非癌性组进行颜色编码，其中绿色代表非癌组织，红色指示癌性区域 [图 4(c) 和 4(d)]。活体 [图 4(e)] 和离体 [图 4(f)] 条件下的相位图说明了这些癌性（红色）和非癌性（绿色）区域的数据点。相位图揭示，与活体（??=0.84）条件相比，离体（??=0.65）设置下癌性与非癌组织之间的可分离性降低。
图 4
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展示组织从活体到离体的转变，显示白光下的舌背。(a) 一名 57 岁男性患者的活体和 (b) 离体图像。(c) 活体和 (d) 离体设置中 FLIm 测量点的叠加，健康组织和癌性组织分别用绿色和红色进行颜色编码。FLIm 数据点绘制在 (e) 活体和 (f) 离体测量的相位图上。组织切除后，癌性与非癌组织之间的分离度降低。(g) 活体和 (h) 离体的直方图以及 (i) 活体和 (j) 离体的荧光衰减曲线得以展示。直方图特征显示，从活体到离体存在明显偏移。
荧光寿命值的直方图 [图 4(g) 和 4(h)] 显示，在离体条件下，癌性组织的寿命向较短方向偏移（???(c): 3.39 ns→3.08 ns），而非癌性组织变化极小（???(nc): 3.13 ns→3.19 ns）。此外，离体分布显得更宽，表明组织切除后异质性增加。荧光衰减曲线 [图 4(i) 和 4(j)] 进一步展示了切除后衰减动力学的改变，这与观察到的相位分布偏移和组织类型区分度降低一致。

3.2. 不同组织类型和发射波长下活体与离体寿命比较
为了评估这些发现超越单一实例的普适性，我们将分析扩展到整个患者队列（??=75）。图 5 显示了口腔舌组织样本（??=25 名患者）的结果。平均寿命分析显示，在所有光谱通道中，癌性和非癌性组织的寿命值从活体到离体条件均表现出整体增加。
图 5
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口腔舌组织活体和离体 FLIm 测量的相位图和平均寿命直方图，突出了非癌组织和癌组织之间的差异，分别标记为绿色和红色。每个图旁边显示分离度指数（??），数值越高表明癌与非癌组织之间的分离度越好。
在通道 1 中，癌性和非癌性组织均显示出向较长寿命的偏移。平均寿命之间的差异减小（Δ???: 0.22 ns→0.07 ns），且相位云团之间的重叠增加导致分离度降低（??: 0.20→0.07）。在通道 2 中，观察到相似的趋势，两种组织类型均向较长寿命偏移，非癌性组织保持较高的寿命值。尽管平均寿命之间的差异略微增加（Δ???: 0.10 ns→0.15 ns），但离体条件下相位云团之间重叠的增加导致分离度降低（??: 0.27→0.18）。在通道 3 中，癌性和非癌性组织的寿命值也增加，平均寿命差异略有增加（Δ???: 0.07 ns→0.10 ns），但在离体条件下更宽的分布和增加的重叠导致分离度降低（??: 0.26→0.16）。在所有通道中，寿命直方图显示离体条件下向较长寿命的偏移，伴随着更宽的分布和增加的重叠，表明组织切除后异质性增加。总体而言，口腔舌组织在两种组织类型中均表现出寿命增加和分离度降低。

图 6 显示了舌根组织样本（??=19 名患者）的结果。在该组中，行为在不同通道间存在差异。在通道 1 中，癌性和非癌性组织的平均寿命在从活体转变为离体时均增加。相反，在通道 2 和 3 中，癌性组织的寿命减少，而非癌性组织的寿命增加，导致两种组织类型之间出现相反的趋势。这与口腔舌形成对比，在口腔舌中，两种组织类型在离体时均表现出寿命的整体增加。在通道 1 中，两种组织类型的寿命均增加（3.01 ns→3.13 ns 和 3.28 ns→3.48 ns），分离度相应增加（??: 0.33→0.38）。在通道 2 中，癌性组织的寿命减少（3.46 ns→3.36 ns），而非癌性组织显示增加（3.59 ns→3.65 ns），导致分布之间的分离更大，分离度显著增加（??: 0.15→0.43）。在通道 3 中，观察到相似的相反趋势，癌性组织的寿命减少（3.52 ns→3.36 ns），而非癌性组织增加（3.64 ns→3.68 ns），导致分离增强和分离度增加（??: 0.13→0.39）。
图 6
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舌根组织活体和离体 FLIm 测量的相位图和平均寿命直方图，突出了非癌组织和癌组织之间的差异，分别标记为绿色和红色。每个图旁边显示分离度指数（??），数值越高表明癌与非癌组织之间的分离度越好。
舌根中癌性与非癌组织之间这些相反的趋势增加了分布之间的有效距离，同时减少了重叠，这与观察到的在所有通道中从活体到离体分离度增加一致。总体而言，舌根组织在癌性和非癌区域表现出相反的寿命偏移，导致离体条件下诊断分离度增强。

图 7 显示了腭扁桃体组织样本（??=31 名患者）的结果，其行为不同于口腔舌和舌根。在通道 1 中，癌性和非癌性组织在从活体转变为离体时均显示寿命增加（分别为 3.14 ns→3.30 ns 和 3.36 ns→3.51 ns），伴随着重叠增加和分离度降低（??: 0.29→0.18）。在通道 2 中，癌性组织的寿命增加（3.22 ns→3.33 ns），而非癌性组织显示寿命减少（3.59 ns→3.52 ns），导致相反的趋势；然而，分布之间重叠的增加导致分离度降低（??: 0.46→0.28）。在通道 3 中，观察到相似的相反模式，癌性组织显示寿命增加（3.11 ns→3.20 ns），而非癌性组织寿命减少（3.62 ns→3.43 ns），再次导致重叠增加和分离度降低（??: 0.50→0.26）。
图 7
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扁桃体组织活体和离体 FLIm 测量的相位图和平均寿命直方图，突出了非癌组织和癌组织之间的差异，分别标记为绿色和红色。每个图旁边显示分离度指数（??），数值越高表明癌与非癌组织之间的分离度越好。
尽管寿命变化趋势在不同通道中有所不同，但相位分布和相应的直方图均显示离体条件下存在更大的重叠。值得注意的是，腭扁桃体组织在所有组织类型中表现出最高的活体条件下分离度（通道 3 中 ??=0.50）。总体而言，离体条件下分布重叠的增加导致扁桃体组织诊断分离度降低。
在所有组织类型中，分离度与癌性和非癌性寿命分布之间的相对距离和重叠相关。在口腔舌组织中，两种组织类型向同一方向偏移，伴随着重叠增加和分离度降低。在舌根组织中，癌性和非癌区域之间相反的寿命偏移与分离增加和更高的分离度相关。在扁桃体组织中，观察到混合和部分相反的趋势；然而，离体条件下重叠的增加对应于分离度降低。

3.3. 不同组织类型和发射波长下癌症与非癌症寿命比较
为了评估荧光寿命特性如何在活体和离体条件之间变化，我们比较了每种组织类型内的相应分布，分别评估癌性和非癌性区域。在此背景下，分离度反映了每种组织类别中活体和离体测量之间的区别。
图 8 展示了口腔舌组织活体与离体测量之间的分离情况，分别独立评估非癌性和癌性区域。在非癌性组织中，分离度在不同通道间变化，通道 2 中观察到最高的分离（??=0.50），其次是通道 3（??=0.28）和通道 1（??=0.19）。相比之下，癌性组织表现出较低且变化更大的分离度，通道 1 中最高（??=0.30），通道 2 中降低（??=0.22），通道 3 中达到最低水平（??=0.08）。活体–离体分离度在不同组织类型和光谱通道间存在差异，非癌性组织在通道 2 中显示较高的分离，癌性组织在通道 1 中显示最高的分离。
图 8
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口腔舌组织非癌性和癌性组织的相位图和平均寿命直方图，突出了活体和离体 FLIm 测量之间的差异，分别标记为绿色和蓝色。
图 9 展示了舌根组织活体与离体测量之间的分离情况。在非癌性组织中，所有通道的分离度都很低（通道 1 至 3 分别为 ??=0.21、0.12 和 0.15）。

相比之下，癌组织在通道1中显示出极低的分离度（??=0.09），但在通道2和通道3中分离度较高（??=0.30和0.32），表明在较长波长条件下两种组织间的区分度更强。

**图9** 下载 全尺寸图片 舌根部位癌组织与非癌组织的相量图和平均寿命直方图，突显了在体与离体FLIm测量之间的差异，分别用绿色和蓝色标注。

**图10** 显示了扁桃体组织在体与离体测量之间的分离情况。在非癌组织中，通道1和通道2的分离度较低（??=0.08和0.09），而通道3的分离度较高（??=0.25）。在癌组织中，各通道的分离度均较低至中等（??=0.09、0.15和0.12），表明两种条件下的区分度有限。

**图10** 下载 全尺寸图片 扁桃体部位癌组织与非癌组织的相量图和平均寿命直方图，突显了在体与离体FLIm测量之间的差异，分别用绿色和蓝色标注。

**图11** 汇总了基于图5–7中数据集得出的相量分布质心位置，将所有组织类型（口腔舌、舌根和扁桃体）和条件（在体和离体）整合到单一表示中。每个点对应给定组织类型和条件下的平均相量位置，其中??符号表示在体测量，??符号表示离体测量，颜色区分癌组织（红色）和非癌组织（绿色）。

**图11** 下载 全尺寸图片 所有组织类型相量云中心的相量图。分离度指数用绿色和红色符号之间的距离表示，癌组织在在体条件下向较短寿命方向偏移。绿色代表非癌组织，红色代表癌组织。此外，??符号代表离体数据，??符号代表在体数据。

在各组织类型中，呈现出不同的模式。在口腔舌和扁桃体组织中，在在体条件下癌组织与非癌组织的质心分离度更大，尤其是在通道2和通道3中。相反，舌根组织在离体条件下显示出更大的分离度。此外，在在体状态下，癌组织相对于离体状态持续向较短寿命方向偏移，这反映在红色标记的位置上。这些观察结果与表2中汇总的分离度指数一致，其中舌根组织在离体条件下表现出更高的分离度，而口腔舌和扁桃体在大多数通道中在在体条件下的分离度更高。这些质心关系总结了组织类型和测量条件如何影响荧光寿命分离度。

**表2** 舌根、口腔舌和扁桃体的分离度指数。

| | 通道1 | 通道2 | 通道3 |
|---|---|---|---|
| | 在体 | 离体 | 在体 | 离体 | 在体 | 离体 |
| 舌根 | 0.33 | 0.38 | 0.15 | 0.43 | 0.13 | 0.39 |
| 口腔舌 | 0.20 | 0.07 | 0.27 | 0.18 | 0.26 | 0.16 |
| 扁桃体 | 0.29 | 0.18 | 0.46 | 0.28 | 0.50 | 0.26 |

### 4. 讨论

本研究结果表明，在在体测量中获得的荧光寿命特征在组织切除后并不直接保留，且这些变化的方向和幅度取决于解剖部位。虽然先前的FLIm研究主要关注在体肿瘤鉴别，但我们的结果表明，转变为离体条件会在荧光寿命分布中引入组织特异性的偏移，从而改变诊断分离度。值得注意的是，荧光寿命变化的方向和幅度在不同组织类型或光谱通道之间并不一致，表明没有单一转换能够可靠地将在体测量映射到离体条件。这些结果表明，荧光寿命对比不仅受组织特性影响，还受成像时切除后生理变化的影响。

先前的FLIm研究已证明在在体条件下癌组织与非癌组织之间存在显著鉴别能力；然而，这些研究并未充分探讨组织切除后是否保持相同的荧光寿命特征。相比之下，我们的结果表明，虽然离体条件下癌组织和非癌组织仍可区分，但潜在的寿命分布发生了偏移。具体而言，离体测量的直方图分布比其在体对应值更宽。这些展宽的分布很可能反映了切除后的快速生理和生化变化，包括灌注丧失、氧气耗竭和细胞代谢中断。然而，这些变化对分离度的影响程度仍取决于组织类型。

各解剖部位观察到的变异性可能源于组织成分和微环境的差异。例如，舌根含有较高比例的淋巴组织和腺体组织，而口腔舌在结构上更多由肌肉和基质主导。这些成分差异，包括血管密度、灌注和肿瘤微环境条件的变化，影响了代谢性（NAD(P)H、FAD）和结构性（胶原蛋白）荧光团的相对贡献，导致切除后对缺血和代谢中断产生不同的反应。30,31 这些差异很可能调节了荧光寿命信号对切除后生理变化的敏感性。

更重要的是，诊断性能取决于荧光寿命分布的相对分离度和重叠程度，而非仅取决于平均寿命值的差异。如口腔舌组织中所观察到的（图5），在离体条件下癌组织和非癌组织的平均寿命均增加，在某些通道中平均寿命的差异甚至增大（例如通道2）。然而，这伴随着更宽的分布和更大的重叠，导致与在体条件相比分离度降低。这凸显了仅依赖平均寿命指标的一个关键局限性，即它们无法捕捉荧光衰减的多指数特性或决定诊断对比度的分布级别变化。相比之下，基于相量的分析通过保留完整的分布特征，更有效地反映了这些差异，从而实现更准确的组织分离度评估。

当前研究结果还表明，FLIm在各种组织类型间的鉴别能力在在体和离体成像之间存在差异，其中口腔舌和扁桃体在在体条件下显示出更高的对比度，而舌根在离体条件下表现出改善的鉴别能力。这些结果表明，组织类型和解剖位置在确定FLIm的最佳利用方式时都是重要的考虑因素，并强化了结合在体和离体成像策略以发挥各自优势的价值。每种组织类型内部的在体-离体比较（图8–10）进一步支持了这一观察，显示出各组织间和通道间存在不同的分离度模式。

从临床角度来看，这些结果表明，基于离体测量得出的FLIm诊断方法可能无法直接转化为术中在体使用。这对基于机器学习的分类具有重要影响，因为每种成像条件都表现出不同的荧光寿命特征，从而影响性能。因此，不能假设使用离体数据开发的模型可以推广到在体环境，可能需要分别的开发和验证策略。理解这些诊断差异的根源需要研究荧光寿命分布及其相关分离度在在体和离体环境之间的差异，32,33 以及快速的切除后生理变化。34 虽然离体FLIm显示出前景，但其临床应用需要解决离体成像流程中的独特挑战。在此背景下，标准化采集时间并开发对这些变化具有鲁棒性的分析方法可能提高可重复性并促进转化应用。

将FLIm整合到手术流程中需要兼顾在体和离体成像环境各自的优势和局限性。14,35 离体成像的一个优势是能够使用更高的激发光强度和更长的采集时间，从而提高信噪比。此外，离体成像允许评估组织的所有表面，从而对切除标本的表面进行全面评估。这与在体测量形成互补，后者可用于评估深部切缘并直接在手术腔内识别残留肿瘤。36 虽然离体格式改善了与下游组织病理学的关联，但必须解决技术挑战才能将阳性切缘发现准确映射回手术部位。结合两种成像条件的综合工作流程可能提供更全面的术中评估。

本研究的设计旨在与临床工作流程无缝整合，通过在标本切除后采集配对的在体和即时离体FLIm测量。因此，不同病例之间的测量间隔有所变化，反映了常规手术和标本处理流程。此外，仅纳入了在手术室中、转移至组织病理学实验室之前采集的初始离体测量。虽然这一设计实现了具有临床意义的在体与即时离体测量之间的比较，但未能评估组织切除后荧光寿命的时间演变。虽然通道4可能提供与卟啉和组织氧合相关的生物学信息，但本研究中的荧光信号不足以进行可靠的寿命分析。此外，某些解剖部位缺乏癌组织样本的代表性，且各解剖亚组内的样本量仍然有限，这可能影响组织特异性观察的普适性并影响分离度估计的鲁棒性。最后，本研究仅限于头颈癌，需要在其他组织类型中进行进一步验证。11,18

未来的工作应着重于扩大所研究组织的范围，并表征组织切除后荧光寿命变化的时间演变，这有助于改善离体信号动力学的建模。此外，将多通道和空间特征纳入分析框架可能增强诊断鲁棒性，并支持在不同成像条件下改善泛化能力。这些工作对于将FLIm有效整合到手术引导和病理学工作流中至关重要。

### 5. 结论

本研究证明，荧光寿命特性会以依赖于组织和波长的方式受到组织切除的影响。这些变化直接影响诊断分离度，并凸显了对FLIm数据进行条件特异性解读的必要性。综合而言，这些结果表明，荧光寿命对比取决于成像时组织的生理状态，而不仅仅是由组织的固有特性决定，强调了条件特异性解读对于FLIm可靠临床转化的重要性。